Диссертация (1091787), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Например,E-NH2 + НООС-АгE-NH-CO-Аг + Н2ОЕсли прямое взаимодействие реализовать не удается, в ход идут бифункциональныесшивающие агенты: глутаровый диальдегид, n-бензохинон. Функциональные группыреагентов могут быть активированы. Так, гидроксигруппы в углеводном компонентепероксидазы хрена можно окислить с помощью периодата натрия до альдегидных, черезкоторые затем пришиваются антиген или антитело при участии аминогрупп с65образованием основания Шиффа [98]. В чем и состоит принцип периодатного метода(метода Накане). Данный метод был впервые предложен японскими исследователямиНакане и Каваои (1974) и с тех пор он наиболее употребим для получения конъюгатовантител или белков с пероксидазой хрена [93].
Пероксидаза содержит 6 лизиновыхостатков из, примерно, 300 аминокислот, но только 1 или 2 из них стерически доступны(связывают 1-фтор-2,4-динитробензол). Недостаток активных NН2-групп может бытьустранен путем окисления углеводных остатков до альдегидных групп, т.к. пероксидазасодержит 8 углеводных цепей, составляющих 21% от молекулярной массы фермента.Альдегидные группы вступают в реакцию с амино-группами белков с образованиемоснования Шиффа. Для того, чтобы не происходило полимеризации окисленнойпероксидазы, ее амино-группы предварительно блокируют либо с помощью 1-фтор-2,4динитробензола, либо с помощью протона. Тем не менее, оба эти способа необеспечивают полной блокировки амино-групп и степень полимеризации пероксидазысоставляет 35% и 5% соответственно.
За счет уменьшения избытка окислителя можноподобрать условия, не требующие блокировки амино-групп. После стадии образованияоснования Шиффа необходимо восстановление иминовой связи, чувствительной кгидролизу в щелочной среде, с помощью боргидрата натрия. Кроме того, это необходимодля восстановления непрореагировавших альдегидных групп пероксидазы и уменьшения,тем самым, степени полимеризации конъюгата.Для каждой стадии проведения этих методов важно соблюдение таких условий какрН, температура, время и молярное соотношение реагентов [99].Рисунок 26. Схема метода Накане. Модификация пероксидазы хрена (ПХ) окислением периодатом натрия,с образованием активных альдегидных групп, которые на последующей стадии реагируют с аминогруппойиммуноглобуллина G (IgG) с образованием основания Шиффа.
Восстановление иминовой связи при помощиборгидрата натрия.66Иммунологические методы получения антигенов или антител, меченных ферментами,основаны на применении антител или их составляющих в качестве сшивающих звеньев.Метод гибридных антител для сшивки антигена с ферментом включает несколько этапов(рис. 27).A)B)Рисунок 27. Обработка антител класса G пепсином и папаином (А). Получение комплекса антигена Аг ифермента Е методом гибридных антител (В).Генно-инженерный метод получения меченого антигена основан на синтезегибридных белков с помощью микроорганизмов. Таким методом, используя трансгеннуюЕ.
соli, в лаборатории Е.С. Северина получены гибридные белки, содержащие полнуюаминокислотную последовательность бактериальной β-галактозидазы и специфическуюпоследовательность белка от вируса иммунодефицита человека или вируса гепатита В.Сохранение нативной структуры и функции сшиваемых реагентов зависит от ихиндивидуальных особенностей, поэтому здесь не может быть применен какой-либостандартный прием. Конкретный метод сшивки подбирается в индивидуальном порядке[99].2.9.3. Методы получения антител для ИФА.Антитела получают путем иммунизации животных соответствующим антигеном: влабораторных условиях это мыши, морские свинки, кролики, на производстве овцы, козы,лошади.
При использовании в производстве антител кур, после иммунизации антителавыделяют из желтков яиц [99]. С учетом того, что антиген, используемый дляиммунизации животного, содержит не одну, а несколько антигенных детерминант, можно67представить, какое множество антител вырабатывается в организме на введение одногоантигена. Такие антитела называются поликлональными. Они гетерогенны по сродству кантигенам. Их состав непостоянен и зависит от вида животного, его генетическихособенностей и физиологического состояния [100, 101].Препараты моноклональных антител характеризуются постоянством состава и физикохимических свойств, низкой вероятностью перекрестной реакции с "чужими" антигенами.Это высокотехнологичный продукт [102].Метод производства моноклональных антител в условиях in vitro является болеепредпочтительным.
Это позволяет обеспечить надлежащий контроль производственногопроцесса, стандартизацию, а также имеет важные преимущества над производством вусловиях in vivo в отношении вирусной безопасности, постоянства производства иотсутствия контаминирующих иммуноглобулинов в неочищенных сборах. Другиепреимущества этого метода производства заключаются в использовании культуральныхсред без сыворотки, а также в значительном сокращении использования животных. [103,104].2.9.4. Классификация методов иммуноферментного анализа.Первичным процессом в иммуноферментном и в любом другом иммунохимическоманализе является стадия «узнавания» анализируемого соединения специфическим к немуантителом.
Так как процесс образования иммунохимических комплексов происходит встрого количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациямикомпонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходнойконцентрациианализируемогосоединенияявляетсяколичественнаяоценкаобразовавшихся иммунных комплексов.В случае анализа антигенов для проведения такой оценки существует два подхода:1) прямое измерение концентрации образовавшихся иммунохимических комплексов;2) определение концентрации оставшихся свободными, т.
е. не вступивших в реакциюкомплексообразования с антигеном антител.Второй общей стадией любого метода ИФА является формирование связи меченногоферментом соединения со специфическим комплексом или свободными центрамисвязывания. В некоторых схемах (конкурентный анализ) образование комплекса смеченным ферментом соединением может проходить одновременно с первой стадией«узнавания» антителами специфических антигенов. И, наконец, последним обязательнымпроцессом в ИФА является «трансформация» ферментной метки в соответствующийсигнал,измеряемыйразличными68физико-химическимиметодами(спектрофотометрическими, флуориметрическими, люминесцентными и т. д.), чтодостигается путем проведения реакции фермента с субстратами.Если на первой стадии в системе присутствуют только анализируемое соединение исоответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то методявляется неконкурентным.
Если на первой стадии анализа в системе одновременноприсутствует анализируемое соединение и его аналог, конкурирующие за имеющиеся вотносительном недостатке центры специфического связывания, то метод являетсяконкурентным. Также методы можно разделить на две группы - гомогенные игетерогенные.
Если в ходе выполнения анализа все реакции, включая ферментативнуюстадию, протекают в растворе, то метод является гомогенным.Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазнойсистеме, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения.Гетерогенные методы включают обязательную стадию разделения свободного иобразовавшего специфический комплекс меченого соединения, которые находятся вразных фазах.Если же на первой стадии анализа образование специфических иммунных комплексовпроисходит в растворе, а лишь затем для целей разделения используют твердую фазу симмобилизованным реагентом, то такие методы целесообразно классифицировать какгомогенно-гетерогенные.
Классификация методов ИФА представлена в виде схемы нарисунке 28.Рисунок 28. Классификация методов ИФА.69Многообразие методов гетерогенного анализа, относящихся к типам I и II,обусловлено возможностью введения ферментной метки как в молекулу антигена, так и вмолекулу антитела. Кроме того, для конкретной схемы анализа определяющим является,какой из реагентов - антитело или антиген, использован в иммобилизованном виде дляразделения иммунохимических комплексов от несвязавшихся компонентов [90, 96].В каждом варианте твердофазного ИФА можно выделить следующие общие этапы:- получение иммуносорбента;- формирование многослойного комплекса на твердой фазе за счет последовательногопроведения специфических реакций;- удаление неспецифически связавшихся компонентов, а также их избытка;- получение ферментного конъюгата;- измерение ферментативной активности специфического комплекса на твердой фазе;- интерпретация результатов анализа.В твердофазном ИФА конъюгат проявляет свою ферментативную активность, будучииммобилизованным на твердой фазе.
Это приводит к появлению ряда особенностей посравнению с ферментативными реакциями, протекающими в растворе.2.9.4.1. Схемы методов твердофазного ИФА.Наиболее распространены методы ИФА для выявления антигенов, основанные наопределении специфических иммунных комплексов (тип I, рисунок 29), все они являютсянеконкурентными.Методы с использованием меченых антител и иммобилизованных антител. Один изнаиболее распространенных на практике методов основан на применении меченныхферментом специфических антител и иммобилизованных антител.Рисунок 29. Схема метода ИФА с использованием меченых антител и иммобилизованных антител.I – инкубация №1; II – отмывка №1; III- инкубация № 2; IV- отмывка №2; V – определение ферментативнойактивности- проинсулин;- специфическое антитело.- пероксидаза хрена;70К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащийанализируемый антиген.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
