Диссертация (1091787), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Репликация начинается сразу в несколькихместах молекулы. На одной цепи (лидирующей) этот процесс идет не прерываясь; другаяцепь копируется фрагментами (фрагменты Оказаки).На следующем этапе элонгации (удлинения цепи ДНК) полимераза, достраивает обенити ДНК навстречу друг другу, последовательно присоединяя дезоксирибонуклеотиды,согласно строению копируемого фрагмента. Температура на этом этапе оптимальна дляработы Taq-полимеразы и составляет 72°C (рисунок 10).После этого следует многократное повторение цикла, состоящего из денатурацииотжига-элонгации в автоматическом режиме. В результате 20-40 циклов ПЦР происходитмногократное увеличение количества копий (амплификация) выбранного фрагмента ДНК,ограниченного двумя праймерами.Кроме температуры отжига (связывания с копируемой ДНК) праймеров программыамплификации могут отличаться друг от друга и количеством циклов.
Чем больше циклов,тем больше продукта может образоваться в результате ПЦР.Рисунок 10. Этапы ПЦР.Метод ПЦР является прямым и самым современным методом анализа ДНК. Данный45метод позволяет специфично увеличивать количество исследуемого образца ДНК в сотнираз. Специфичность данного метода очень высока, достигает 100%. Прямое определениеспецифического участка ДНК, применяемое методом ПЦР, имеет ряд преимуществ посравнению с традиционными методами исследования. На ОБП ИБХ РАН метод ПЦРпозволяет определить наличие остаточной ДНК штамма-продуцента в инсулине, дажеесли в пробе присутствует всего несколько фрагментов молекул ДНК штамма-продуцента.Метод ПЦР универсален, очень широко применяется в клинической диагностике. МетодПЦРобнаруживает(иммунологическими,наличиеДНКвтехбактериологическими,случаях,когдадругимимикроскопическими)этометодамисделатьневозможно.
В настоящее время метод ПЦР является, пожалуй, самым точным ичувствительным методом идентификации микроорганизмов [63].2.8.2. Детекция проведения амплификации (электрофорез)Горизонтальный электрофорез в агарозном геле – стандартный метод, используемыйдля идентификации фрагментов ДНК.Готовят агарозный гель с добавлением этидия бромида. Гель кладут в специальнуюкамеру с электорофорезным буфером. Камеру подключают к источнику тока.
Поддействием тока ампликоны движутся в геле в определенном направлении: ототрицательно (катода) к положительно заряженному электроду (аноду).Затем гель помещают под свет ультрафиолетовой лампы, под действием которогообразовавшийся комплекс ДНК с бромистым этидием начинает флуоресцировать.Фрагменты ДНК одного размера располагаются на одном расстоянии от стартовой линиив виде светящейся полоски. Для определения уровня расположения полоски используетсяположительный контроль. Пробы, в которых регистрируются фрагменты, расположенныена уровне положительного контроля, считаются положительными, остальные являютсяотрицательными.Образцы, поступившие на форез, являются мощным и серьезным источникомконтаминации.
Контаминация - загрязнение чужеродной ДНК на разных этапахпроведения исследования, приводящее к получению ложноположительных результатов.Ампликоны – стабильные и летучие небольшие фрагменты ДНК, накопленные вогромном количестве, сами могут являться отличной матрицей для копирования.Скорость прохождения ДНК через агарозный гель при элекрофорезе определяетсяследующими параметрами:Размером молекул ДНК. Чем меньше длина ампликона, тем быстрее он движется итем дальше он уходит от старта.46Концентрацией агарозы. Чем выше концентрация, тем медленнее движутсяампликоны.Температурой. Чем выше температура буфера в электрофоретической камере, тембыстрее движутся ампликоны.Напряженностью электрического поля. Чем выше напряжение, тем быстрее движутсяампликоны.1000 п.
о.750 п. о.500 п. о.250 п. о.1нг70пг30пг10пг3пг1пг0,3пг0,1пг0пгMРисунок 11. Электрофореграмма амплификатов фрагмента гена bla (252 п.о.) в 1,5% агарозном геле вприсутствии этидия бромида, полученных в ПЦР с использованием суммарной ДНК продуцента инсулина вкачестве матрицы. Количества введённой в реакцию матрицы отмечены под стрелками. М – маркерымолекулярного веса.Рисунок 12.
Амплификатор T100™ Thermal Cycler, для проведения ПЦР без возможности детекциинакопления ДНК продуктов во время реакции.Посколькувходеполимеразнойцепнойреакциипроисходитнаработкаопределенного участка ДНК, по окончании реакции можно зарегистрировать полученный47фрагмент при помощи ряда методов, первым и наиболее часто используемым из которыхявляется метод электрофореза молекул ДНК в геле в окрашиванием бромистым этидием.Однако регистрация результата реакции по ее завершении не дает информации обэффективности процесса (если не использовать специальную постановку эксперимента),снижая тем самым потенциальную информативность ПЦР. Применение метода былоограничено задачами, в которых было достаточно ответа «да» - «нет» [64].2.8.3. ПЦР в режиме реального времени.В начале 90-х годов прошлого столетия исследователи предложили регистрироватьнакопление ДНК непосредственно в ходе ПЦР [65].
К этой идее их подтолкнуло желаниеиспользовать метод ПЦР для количественного определения исходного числа матриц,попавших в реакционную пробирку. Несмотря на то, что ПЦР ранее использовали дляколичественного определения нуклеиновых кислот, изобретение рвПЦР существенноупрощало технику измерения и делало подход более точным [66].В молекулярной биологии, ПЦР в реальном времени (или количественный ПЦР, англ.Real-time PCR, qPCR) — лабораторный метод, основанный на методе полимеразнойцепной реакции, используется для одновременной амплификации и измерения количестваданной молекулы ДНК.
Метод ПЦР в реальном времени включает в себя одновременнодетекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий,либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочныхгенов) специфической последовательности ДНК в образце.Метод в общем использует общие принципы ПЦР, основное отличие состоит в том,что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждогоцикла амплификации. Для количественного определения используют два метода —флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК имодифицированные дезоксинуклеотиды, которые флюоресцируют после гибридизации скомплементарными участками ДНК.48Рисунок 13. График нарастания флуоресценции при амплификации после сглаживания. Стадии накопленияампликона в ходе ПЦР.
Установление порогового значения и определение пороговых циклов длянеизвестной пробы (Ct1) и образца сравнения (Ct2).Очень важной характеристикой реакции рвПЦР является значение ее эффективности.В идеальной реакции ПЦР на каждом последующем цикле количество продукта реакцииудваивается, то есть эффективность равна 2, в реальности данный коэффициент меняетсяна протяжении реакции (особенно в конце реакции, вследствие истощения субстрата –праймеров, а также конкуренции между процессами отжига праймеров и реассоциацииампликонов).
Тогда количество ДНК в цикле n можно выразить формулой:Nn = N0·En,где E – эффективность ПЦР (1<E<2), иногда Е выражают в процентах, тогдаNn = N0·(1+E)n,в этом случае 0<E<1.Для повышения эффективности ПЦР используют различные подходы. Модифицируютпротокол экстракции ДНК при пробоподготовке к ПЦР реакции, а также изменяютпоследовательность праймеров и зондов [67, 68]. В ходе оптимизации ПЦР реакцииоценивают специфичность праймеров, путем введения в реакцию ДНК, выделенной изразличных источников. При этом может использоваться как бактериальная ДНК, так иДНК эукариотов. Затем проводят оценку получившихся кривых и рассчитываютэффективность таких реакций.
При оценке остаточной ДНК в биологических продуктах,биофармацевтических субстанциях, помимо четкой проработки и оптимизации методики,важным этапом является валидация полученного метода, с надлежащей оценкой всехнеобходимых валидационных характеристик [69, 70].49Сложный рвПЦР пригоден для комплексной генной идентификции, основанной наиспользовании флоурохромов и анализа кривых плавления амплифицированныхпродуктов.
Этот сложный подход показал высокую чувствительность в реакцияхдуплексов и является полезной альтернативой рвПЦР, основанной на последовательноспецифических пробах, например, химия TaqMan.МожносуверенностьюконстатироватьбыстроезамещениеобычнойПЦРметодиками с флуоресцентной регистрацией накопления ДНК в области выявленияколичественного определения нуклеиновых кислот (рис.
14). В первую очередь этосвязано с удобством процедуры за счет отсутствия отдельной стадии детекциирезультатов ПЦР. Кроме того, флоуресцентные методы позволяют избирательнорегистрироватьамплификациюлишьиспользованияолигонуклеотидныхопределенныхпроб),повышаяфрагментовтемсамымДНК(засчетдостоверностьисследования.
Наряду с этим, обычная ПЦР сохраняет свои позиции в методиках,требующих наработки фрагментов ДНК с целью их дальнейшего использования(клонирования,определенияпоследовательностиит.п.).Здесьдополнительныекомпоненты могут помешать последующим процедурам и их лучше исключить из составареакционной смеси.ПЦРПолучение информации- анализ уровняпредставленноститранскритпов- in situ ПЦРПолучение материи- Клонирование ДНК-ДНК-диагностика-Дифференциальный-Вычитающаягибридизацияв медицине- генотипированиедисплей- in vitro мутагенез и др.Рисунок 14. Разделение ПЦР по принципу решаемой задачи. рвПЦР наилучшим образом подходит для«информативной» ПЦР.2.8.3.1.
Отличие анализа продуктов ПЦР «по конечной точке» и «вреальном времени».Регистрировать результат ПЦР можно либо по завершении амплификации, либо вовремя этапов реакции. Классическая ПЦР предполагает анализ результатов реакции «поконечной точке». Для этого используют методы электрофоретического разделения50продуктовреакциивгеле,гибридизационно-ферментатифныйанализ(ГИФА),флуоресцентную детекцию после ПЦР и др.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
