Диссертация (1091787), страница 10
Текст из файла (страница 10)
ПЦР была открыта в 1983 году. За открытиеэтого метода Кэрри Мюллис в 1995 году был награжден нобелевской премией [61].Изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) явилось революцией в науке. ПЦРв режиме реального времени, далее сокращенно рвПЦР, становится всеобщиминструментом для определения и количественного определения профилей экспрессииотобранных генов. Технология определения ПЦР продуктов в режиме реального времени,то есть, во время реакции, было доступно в течение последних 10 лет, но явноеувеличение применения (рвПЦР) наблюдается в последние годы.
Поиск, использующийключевые слова «режим реального времени» и «ПЦР» дал выход семь публикаций в1995г., 357 в 2000г., и 2291 и 4398 публикаций в 2003 и 2005г.г. соответственно. Во времяэтого изложения было 3316 публикаций в 2006г. Подавляющее большинство нынешнихпубликаций в области генной инженерии имеют дело с различными аспектамиприменения методов в медицине, с учетом проведение поиска новых методов,обеспечивающих наиболее точные показатели и учитывая толкование принциповбиохимических и биофизических процессов, лежащих в основе фенотипическойэкспрессии и клеточной регуляции.
При этом оборудование для проведения рвПЦРотвечают всем требованиям рутинного анализа [62].В медицине данный метод применяется при диагностике инфекционныхионкологических заболеваний, иммунных патологий. ПЦР используют для идентификацииличностииопределениябиологическогородстваиндивидов.Санитарно-эпидемиологические службы применяют этот метод для контроля микробиологическогозагрязнения окружающей среды и продуктов питания, а также для выявления генетическимодифицированных источников пищи. В научно-исследовательских лабораториях ПЦР41применяют для различных исследований.
Метод позволяет получить исследуемыйфрагмент ДНК в необходимом количестве.Наряду с этим, очень важным аспектом применения ПЦР является использованиеметода на биофармацевтических производствах, с целью контроля содержания остаточнойДНК штамма-продуцента в субстанции рекомбинантного продукта [62].Таблица 5. Сравнительная характеристика методов определения остаточной ДНК в АФСМетодСпецифичностьЧувствительность, пгВремя анализаГибридизацияТотальная ДНКОт 1,52-3 сут.От 52-3 сут.От 252-3 ч.От 103-4 ч.Менее 0,5 пг1,5 – 2 ч.- с радиоактивным зондом- с флуоресцентным зондомСвязывание сфлуоресцентнымТотальная ДНКкрасителемПлазмидная и геномнаяПЦРДНКПЦР в реальном времениПлазмидная и геномнаяДНКНаучные разработки в области биохимии и генетики во время прошлого столетиядали исчерпывающее понимание о молекулярном механизме фенотипической экспрессиигенов. Функция генов большей части генома все еще неизвестна и знания овзаимодействиимежду белками,сигнализирующимивеществамииразличныминебольшими молекулами все еще в значительной степени ограничены.
Для того, чтобыполностью понять регуляцию метаболизма и успешно изменить его, требуется большеинформации об экспрессии гена, идентификации ДНК при помощи белков, факторахтранскрипции, лекарствах и других небольших молекулах.Технологии, основанные на ПЦР детекции, задействующие видоспецифическиепраймеры, оказываются важными в качестве инструментов научного поиска, расширяяобъемзнанийобиологиивзаимодействиярастений/микроорганизмоввключеспециальных требованиях экологии, этиологии и эпидемиологии роста патогенныхмикроорганизмов.Для того, чтобы обеспечить безопасность потребителя и нормативные требования,некоторые методы, основанные на ПЦР, были разработаны и коммерциализированы,чтобы обнаружить и количественно оценить мРНК в различных организмах.
Большинствоиз них основано на использовании внутренних транскрибируемых спейсерных областей впределах ядерных рибосомальных кластеров гена, поскольку они эффективны дляразработки анализов, основанных на ПЦР детекции. Кластеры полностью доступны для42использования универсальных праймеров и типично присутствуют в большом числекопий в клетке, и в то же время часто показывают значительное межвидовое расхождение,при разработке видоспецифичных праймеров. Предел количественного определениянекоторых чужеродных молекул обычно одинаков в присутствии очень высоких фоновыхзначений ДНК [66].Преимуществами применения метода ПЦР в диагностике инфекционных болезнейявляются следующие: прямоеопределениетрадиционныеналичияметодывозбудителейдиагностикивыявляютинфекционныхбелковыеболезней.маркёры,Многиеявляющиесяпродуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что даёт лишь опосредованноесвидетельство наличия инфекции.
ПЦР даёт выявление специфической ДНК и прямоуказывает на присутствие возбудителя инфекции; высокая чувствительность. ПЦР-методы дают возможность обнаруживать патогенныебактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими,бактериологическимиидр.)ихвыявлениеневозможно.Чувствительностьамплифицированных тест-систем составляет около 10 клеток в пробе, достигаямаксимально возможных значений — 1 клетка в пробе, в то время как чувствительностьиммунологических и микробиологических тестов колеблется в пределах до миллионаклеток; высокая специфичность.
Абсолютная специфичность метода обусловлена тем, что висследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного видавозбудителя, фрагмент ДНК; быстрота получения продукта. За счёт автоматизации процесс амплификации занимаетвсего 2-3 часа, а с учётом времени, затрачиваемого на обработку проб и регистрациюрезультатов, определение возбудителя обычно осуществляется в течение одного рабочегодня; работа с любым типом биологического материала, а также с маленькими объемамипроб. Метод ПЦР позволяет проводить определение возбудителя непосредственно вматериале, полученном от больного животного (кровь, сыворотка, мазки, смывы, соскобы,слюна, мокрота, желудочный сок, биопсийный материал).
Для определения не требуетсякультивирование возбудителя; возможность количественного учёта реакции. Метод позволяет осуществлять каккачественное, так и количественное определение возбудителя. Изменение динамики числакопий возбудителя в пробе даёт возможность контролировать виремию или бактериемиюв процессе лечения и однозначно решать вопрос об эффективности терапии;43 безопасностьработы с исследуемым материалом, таккак онможетбытьдезинфицирован химической и термической обработкой в момент его забора, чтоисключает инфицированность специалистов в процессе проведения ПЦР; одномоментность выявления различных возбудителей в одной пробе; простота исполнения за счёт полной автоматизации [62].Разработка методик ПЦР и проведение испытания приборов и оборудования — этоодин из этапов большой работы по внедрению ПЦР-методов в практику диагностическихлабораторий.
В связи с возрастающим интересом к практической ПЦР-диагностике,внедрение методов ПЦР в систему здравоохранения — дело сегодняшнего дня.Термостабильная ДНК-полимераза (Taq-полимераза) выделена из термофильныхбактерий Thermis aquaticus, найденных в 1976 г.
в горячих источниках Еллоустауна(США). Taq-полимераза проявляла высокую активность при температуре 70-75оС, чтопозволило сделать процесс репликации ДНК циклическим. При многократном повторениициклов синтеза происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфическогофрагмента ДНК, что дает возможность из небольшого количества анализируемогоматериала, который может содержать единичные клетки микроорганизмов, получитьдостаточное количество ДНК копий для идентификации их методом электрофореза. Taqполимераза катализирует процесс синтеза ДНК.Таблица 6. Компоненты ПЦР - смеси.КомпонентРольПраймерная параЗатравка инициации процесса амплификации4 пары дезоксинуклеотидтрифосфатовdNTPsСтроительный материал для синтеза копий ДНКИоны магнияНеобходимый компонент для работы полимеразыTaq ДНК полимеразаКатализатор синтеза ДНК, ее главный строительБуферный растворПоддерживает рН раствора и создает оптимальные условиядля работы полимеразыПроцесс ПЦР или процесс амплификации проводят в приборах - амлификаторах.Амплификатор – это прибор, поддерживающий определенную температуру заданноевремя.
Полимеразная цепная реакция проходит в несколько этапов при смене температур.Сначала при температуре 93-95°C происходит денатурация ДНК, т.е. двухцепочечнаяДНК под действием высокой температуры переходит в одноцепочечное состояние.44Затемприварьируемойтемпературевдиапазоне50-65°Cпроисходиткомплементарное связывание (специфический отжиг) праймеров на выбранных участкахДНК. Праймеры – это специально синтезированные небольшие фрагменты одноцепочнойДНК. Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующимпоследовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфическогоучастка.
После комплементарного связыванияпраймеров с одноцепочечной ДНКобразуются участки двухцепочной ДНК. Особенность полимеразы состоит в том, что онане может начинать синтез ДНК без присутствия такого двухцепочечного участка. Ростцепи всегда идет в одном направлении 5’→3’, и одновременно удваиваются обе цепиДНК. Репликация – процесс, в ходе которого родительские молекулы ДНК удваиваются изатем распределяются между дочерними.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
