Диссертация (1091787), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Соответственно, при изменении партииреагентов во время валидации или анализа образцов необходимо контролироватьаналитическое исполнение метода, чтобы обеспечить неизменность по сравнению соригинальной или предыдущей партией.Длядоказательствадокументироватьнеизменностиусловия,выполнениягарантирующиеметода,поддержаниеследуетстабильностиподробнокакдлянекритичных реагентов (напр., буферов, разбавителей или реагентов окисления), так и,что более важно, критичных реагентов.2.6.3.13.
Коммерческие наборыМожно использовать коммерческие наборы, которые используются не в исследованияхфармакокинетики. Поэтому, коммерческие наборы необходимо повторно валидироватьдля обеспечения того, что образцы LLOQ и контрольные образцы, которые будутиспользоваться в реальном диапазоне концентраций, позволят достоверно и точнопроводить анализ образца [50].2.7. Методы определения остаточной ДНК и белков штамма-продуцентав активной фармацевтической субстанции.Одной из главнейших задач в производстве генно-инженерных препаратов являетсяочистка активной фармацевтической субстанции.
В процессе очистки могут быть удаленывсе примеси, включая остаточные примеси штамма-продуцента, такие как ДНК и белки.Такие примеси обычно нежелательны из-за возможных последствий: они могут вызватьаллергические реакции или даже привести к трансфекции клеток, что может статьпричиной развития опухоли.Если существует риск, реальный или мнимый, консенсус по спецификациям и стратегиипо снижению риска для обеспечения безопасности продукции имеет решающее значение.Это особенно актуально в случае клеточных субстратов для производства вакцин, гдемногие из продуктов предназначены для использования у здоровых детей. [47].37Исторически сложилось так, что спецификация для содержания ДНК была первоначальноустановлена в 100 мкг/доза или меньше для парентеральных продуктов [48].
В 1998 году,эта спецификация была изменена до 10 нг/доза или менее для парентеральной продукции[49].Хотя эффекты присутствия остаточной ДНК в терапевтических белках в значительнойстепени неизвестны, ДНК клетки-хозяина может содержать фрагменты ДНК синфекционной или онкогенных активностью. Что делает необходимым свести такиепримеси к минимуму. Способ определения содержания ДНК поэтому должен быть оченьчувствительным, чтобы обнаружить низкие уровни остаточной ДНК клетки-хозяина.
[50]Интерес к измерению остаточной ДНК в рекомбинантных продуктах базируется преждевсего на демонстрации эффективной очистки в процессе производства, а также нанекоторых гипотетических опасениях, что, в редких случаях, в зависимости от системыэкспрессии хозяина, некоторые последовательности ДНК могут быть потенциальноинфекционнымиилионкогенными.Последниеисследованияпоказывают,чтопоследовательности, известные как ретротранспозоны LINE-1, широко распространены вгеноме млекопитающих и являются активными ретротранспозонами, которые могуттранскрибироваться в РНК, подвергнуться обратной транскрипции в ДНК и встать в новоеместо в геноме. Этот интеграционный процесс потенциально может нарушить важныефункции гена или вызывать канцерогенез у млекопитающих. Геномную ДНК измикробных источников можно добавить к риску иммуногенности.
По этим и другимпричинам для производителей необходимо провести очистку продукта от остаточной ДНКв течение производственного процесса и подтвердить низкие уровни содержания вконечном лекарственном веществе с использованием соответствующих специфическихколичественных аналитические методы. Наиболее распространенной методологиейколичественного определения остаточной ДНК в настоящее время является полимеразнаяцепная реакция (ПЦР), надежная и проверенная технология. Как и большинство методовколичественногоопределенияДНК,специфичностьПЦРограниченопоследовательностями, на которые направлены праймеры.
Для решения этой проблемыпроводится амплификация целого генома на основе праймазы. [51].Из нескольких аналитических методов, доступных для количественного определенияДНК, лишь немногие являются подходящими для определения количественногосодержания остаточной ДНК в контексте биологических продуктов. Это обусловленотребованием для обнаружения остаточных количеств в биологических продуктах. Болеетого,попыткиобнаружитьфрагментыДНКопределенныхразмеровпоказалинеобходимость тщательного рассмотрения соответствующих анализов для этой цели.38Аналитические методы, основанные на гибридизации, иммуно-ферментативный метод(Threshold) и количественная ПЦР были рассмотрены, как способные обеспечитьприемлемыерабочиехарактеристики,вчастностипутемпредоставлениясоответствующих уровней чувствительности для оценки остаточного содержания ДНК.Однако выбор аналитического метода также должны быть основан на характеристикахмедицинского препарата.
Представленные данные свидетельствуют, что метод Thresholdможет быть более подходящим для вакцин, которые не обрабатывались ДНКазой, так какпредставляет собой стандартизированный метод с использованием квалифицированныхкомплектов с положительным контролем.
Вполне вероятно, что ПЦР больше подходитдля вакцин, которые обрабатывают ДНКазой, из-за чувствительности и возможностианализа коротких фрагментов. Кроме того, оценка размеров ДНК является оченьпривлекательной особенностью этой технологии, и может дать ценную информацию дляоценки риска. Наконец, гибридизация, как было показано путем совместногоисследования ВОЗ [52], сильно варьируется между лабораториями. Отсутствиестандартизации, а также низкая производительность при определении небольшихфрагментов являются серьезными недостатками этого метода по сравнению с методами,описанными выше. [53] К тому же, из-за ограничения объемов систем, влияющих начувствительность, полный анализ не всегда может быть произведён с использованиемметодов гибридизации и метода Threshold.Белки клетки-продуцента в лекарственном веществе должны по содержанию «непревышать уровня, который можно определить высокочувствительным аналитическимметодом» [53].
Как правило, количество, которое не может быть обнаружено, составляетпримерно100пг.ВсоответствиисдокументациейЕвропейскогоАгентстваЛекарственных Средств для определения того, что содержание остаточных белков илиДНК в лекарственных средствах находится в допустимых пределах, можно использоватьдве стратегии. Можно подтвердить, что при помощи используемого метода удаляетсядостаточное количество примесей или выполнять регулярную проверку финальногопродукта для подтверждения его соответствия.
В случае определения проинсулинподобных иммунореактивных белков их содержание не должно превышать 10 нг на 1 мгсубстанции инсулина [1,2].Предел 100 пг ДНК на дозу, установленный регулирующими органами, примерноравен количеству ДНК из менее чем 17 диплоидных клеток яйцеклеток китайскогохомячка (СНО). Чтобы определить такие небольшие количества ДНК, аналитическийметод должен быть очень чувствительным и надежным.
В принципе, три метода имеют39необходимуючувствительность:гибридизация,методы,основанныенаДНК-связывающем белке, и количественная ПЦР [54].Нужно принять во внимание некоторые различия между методами определенияостаточной ДНК. С помощью гибридизации можно случайно определить тотальную ДНКот нескольких пар оснований до тысяч пар оснований в длину.
Этот метод являетсяспецифичным для источника ДНК, но не для последовательности. Для метода,основанного на ДНК-связывающем белке, требуются фрагменты ДНК длиннее 600 п.о.,чтобы сформировать реакционный комплекс, обеспечивающий сигнал для считывания.Этот метод не специфичен для источника ДНК. Метод ПЦР специфичен к целевойпоследовательности, а количество тотальной ДНК получается из измеренного числа копиймишени [55].Успешное применение ПЦР зависит в основном от целостности, выработки и чистотыизолированной ДНК.
Такие факторы как неполный лизис бактериальных клеток, иналичие ингибиторов ПЦР в образцах две из главных проблем при выборе надлежащийметод извлечения ДНК. Чтобы преодолеть эти препятствия, были выполнены различныеисследования, включающие удаление ингибиторов ПЦР, улучшение протоколов очисткиДНК или добавление помощников ПЦР, таких как бычий сывороточный альбумин [56].Для точного анализа бактериальной ДНК требуется эффективный метод выделениявысококачественной ДНК с удалением ингибиторов, но без уменьшения выработкицелевой ДНК ниже амплифицируемого уровня. Хотя обычный ПЦР обеспечивает быстрееи более надежный метод, чем культивирующие методы, требуются трудоемкие шаги дляоценки продукта амплификации.
Кроме того, эти конечные результаты не очень точные, итолько полуколичественные [57].Поскольку некоторые противоопухолевые препараты вводят пациенту в оченьвысоких дозах инфузии, критерии чистота белка крайне строги. Есть несколько основныхгрупп примесей: связанные с белками примеси, примеси высокой или низкоймолекулярная массы, белки хозяина, остаточные прокариотическая ДНК, бактериальныеэндотоксины. Среди этих примесей бактериальные эндотоксины могут создать наиболеесерьезные проблемы. Известно, что бактериальные эндотоксины или липополисахариды(ЛПС), являются основными компонентами грамотрицательных патогенов, таких какE.coli, Salmonella, Pseudomonas,холерныйвибрион и т.д., которые вызываютнежелательные воспалительные реакции при попадании в кровь. Даже небольшиеколичестваЛПСможетвызватьлихорадку,септическийшок,ракидругиенеблагоприятные последствия [58, 59].
Предел для эндотоксинов составляет 5,0 EU / кг вчас, который представляет собой приблизительный порог дозы пирогенов для человека. К40счастью, бактериальные эндотоксины обладают выраженными физическими свойствами(они очень гидрофобные из-за присутствия липидов в своей молекулярной структуре иотрицательно заряженные из-за фосфатных групп в полисахаридной части), которыепозволяют им быть легко удаленными традиционными хроматографическими методами,такими как ионообменная хроматографии [60].2.8. Метод полимеразной цепной реакции.2.8.1. Основы метода ПЦР.В последние годы все больше молекулярно-биологических методов находят широкоеприменение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства.Один из таких методов - полимеразная цепная реакция.Полимеразная цепная реакция – искусственный процесс многократного копирования(амплификации) выбранного участка ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
