Диссертация (1091787), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Перечень основных технологических операций в производствеинсулина.2.2.1.1. Технологические операции, выполняемы в цехе промышленнойферментации. Выращивание инокулята (посевного материала), Культивирование клеток штамма-продуцента, Сбор и отмывка клеток штамма-продуцента, Разрушение (дезинтеграция) клеток штамма-продуцента, Сбор и отмывка «телец включения», содержащих рекомбинантный белок –препроинсулин (РБ).2.2.1.2. Технологические операции, выполняемые в цехе выделения иочистки. Восстановление и ренатурация рекомбинантного белка, Хроматографическая очистка рекомбинантного белка, Ферментативный гидролиз рекомбинантного белка, Хроматографическая очистка генно-иженерного инсулина человека – стадия 1 Хроматографическая очистка генно-иженерного инсулина человека – стадия 214 Кристаллизация цинковой соли генно-иженерного инсулина человека Сушка активной фармацевтической субстанции генно-иженерного инсулина человека Маркировка и упаковка активной фармацевтической субстанции генно-иженерногоинсулина человека.2.2.1.3 Технологическиелекарственных форм.операции,выполняемыевцехеготовых Получение воды для инъекций. Мойка первичной упаковки, основного и вспомогательного оборудования, Стерилизация(тепловаяипаровая)первичнойупаковкиосновногоивспомогательного оборудования, технологической одежды, Приготовление и стерильная фильтрация растворов препаратов генно-инженерногоинсулина человека – Инсуран Р и Инсуран НПХ, Заполнение и укупорка первичной упаковки растворами препаратов, Контроль механических примесей (для препарата Инсуран Р), Этикетирование, маркировка, вторичная и групповая упаковка, Карантинное хранение препаратов [10].2.2.2.

Требования к контролю качества субстанции генно-инженерногоинсулина человека.К производству стерильных лекарственных средств предъявляются особые требования,направленные на сведение к минимуму риска загрязнения микроорганизмами, частицами ипирогенами. Особенно высокие требования предъявляются к обеспечению качества,подготовке и выполнению технологических процессов, их тщательной отработке ивалидации. Контроль конечной стадии производства или контроль готового продукта неможет рассматриваться как единственное средство обеспечения стерильности или другихпоказателей качества продукции [11].Требования к контролю качества субстанции генно-инженерного инсулина человекаизложены в соответствующих разделах Фармакопеи США 38 издания, 2015 г.

(Ф. США) и вЕвропейской Фармакопеи 8.2 издания, 2014 г. (ЕФ) (таблица 1). Для сравнения приведеныпоказатели Фармакопейной статьи предприятия 2010 г., производитель — ИБХ РАН.Как видно из таблицы 2, инсулин должен быть охарактеризован качественно иколичественно (показатели «Подлинность» и «Количественное определение»). Первыйпоказатель определяется методом ВЭЖХ в сравнении со стандартом, сравнениемхроматографическихпрофилейинсулина15иинсулина-стандарта,расщепленныхспецифическим ферментом на 4 фрагмента («метод пептидного картирования») иопределением биоидентичности (in vivo, на кроликах, по сравнительному содержаниюглюкозы в крови).

Количественное определение проводится также методом обращеннофазовой ВЭЖХ. Количество гормона принято оценивать в международных единицах (ME),при этом 1 ME (IU) = 0,0347 мг инсулина. Естественно, все количественные показателиприводятся на абсолютно сухой вес, поскольку в препарате номинируется влажность,которая реально варьирует от 5 до 10% (показатель 9, таблица 1).Хроматографическиполипептиды,такжеопределяютприсутствующиевродственныеконечномпрепарате),белкитак(инсулиноподобныеназываемыйА-21-дезамидоинсулин (модифицированная молекула инсулина, содержащая в 21 положении Ацепиаминокислотныйостатокаспарагиновойкислотывместоаспарагина)ивысокомолекулярные примеси, а именно, димеры и полимеры инсулина (определениепроводят эксклюзионной ВЭЖХ).

Примеси, номинируемые показателями 4-6 (таблица 1),могут образовываться как при нарушении технологического процесса производствасубстанции, так и при хранении.Важнейшими показателями качества являются содержание иммунореактивных примесей(показатели 2, 7, таблица 1) и содержание ДНК (показатель 12, таблица 1), что связано сбиотехнологическимспособомполученияинсулиначеловекаинеобходимостьютщательного контроля указанных граничных параметров (1 ppm — 1 part pro million, чтосоответствует размерности «пг/мг»). Проинсулиноподобные пептиды и белки штаммапродуцентаопределяютлиборадиоиммуннымметодом(РИА),либометодомиммуноферментного анализа. Остаточную ДНК штамма-продуцента определяют с помощьюгибридизационных методов, либо прямым флюоресцентным определением нуклеиновыхкислот в образцах.

В ИБХ РАН разработан и успешно применяется для контроля содержанияколичества остаточной ДНК в активной фармацевтической субстанции (АФС) метод ПЦР.Необходимостьконтролясодержанияцинкавсубстанцииинсулинасвязанасиспользованием в технологии производства солей цинка для кристаллизации, а также соспецификой получения готовых лекарственных форм инсулина.Приведенные в таблице 1 данные наглядно демонстрируют жесткость требованийпараметров контроля фармакопейной субстанции инсулина человека, причем по отдельнымпоказателямкачества(«Сульфатнаязола»,«Микробиологическая чистота»).16«ОстаточнаяДНКштамма-процуента»,Таблица 1.

Требования к контролю качества субстанции генно-инженерного инсулина человека всоответствующих разделах Американской Фармакопеи, Европейской Фармакопеи и ФСП Р N002254/01-110912№п/пНормируемое содержание показателя качестваПоказательЕФ 8-е издание, 2014 г.Ф. США, 38-е издание,2015 г.Активность не менее27,5 МЕ/мг на абсолютносухой весАктивность не менее27,5 МЕ/мг в пересчетена сухое веществоФСП 2012 г.1КоличественноеопределениеСуммарное содержаниеинсулина и А21дезамидоинсулинадолжно быть не менее95% и не более 105%на абсолютно сухой веспо сравнению состандартом2Остаточные белкиштаммапродуцентаНе более 10 пг/мгНе более 10 пг/мгНе более 10 пг/мг3Подлинностьа) ВЭЖХ в сравнениисо стандартом;б) метод сравненияпептидных карта) ВЭЖХ в сравнении состандартом;б) метод сравненияпептидных карт;в) биоидентичностьа) ВЭЖХ в сравнении состандартом;б) метод сравненияпептидных карт;в) биоидентичность4Высокомолекулярные примесиНе более 1,0%Не более 1,0%Не более 1,0%5РодственныебелкиНе более 2,0%Не более 2,0%Не более 2,0%6А21дезамидоинсулинНе более 2,0%Не более 2,0%Не более 2,0%7ПроинсулиноподобнаяиммунореактивностьНе более 10 пг/мг*Не более 10 пг/мг*Не более 10 пг/мг8ЦинкНе более 1,0%Не более 1,0%От 0,2 до 1,0% впересчете на сухоевещество9Потери в массепри высушиванииНе более 10%Не более 10%Не более 10%10Сульфатная золаНе более 2,5%—Не более 2,5%11БактериальныеэндотоксиныМенее 10 МЕ/мгНе более 10 USP ЭЕ/мгНе более 10 ЭЕ/мг12Остаточная ДНКштаммапродуцентаНетКоличественноезначение не указываетсяНе более 7 пг/мгМикробиологическая чистотаУсловия производствадолжны обеспечиватьминимальный уровеньмикробнойконтаминации13Менее 300 колоний на 1 г17Не более 100 бактерий игрибов суммарно в 1 гпрепарата приотсутствииEnterobactericeae,Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus aureusОпределениебактериальныхэндотоксинов(восновномследовыеколичествалипополисахаридов клеточной стенки бактерии штамма-продуцента) проводят методомЛАЛ-теста (фармакопейный метод для определения бактериальных токсинов, заменившийпоказатель «пирогенность», основанный на повышении температуры у лабораторныхживотных при введении инъекционных препаратов; метод основан на свойстве указанногореактива,выделенногоизклетокморскогорачка,образовыватьсгустокпривзаимодействии с липополисахаридами клеточной стенки бактерий), который успешнозаменил определение пирогенности in vivo.

Согласно данным XIII Государственнойфамкакопеи РФ, наиболее точным и чувствительным зарекомендовал себя хромогенныйметод. Как правило, микробиологическая чистота препарата номинируется, хотя в процессепроизводства готовых лекарственных форм всегда присутствует стадия стерилизующейфильтрации.Готовые лекарственные формы генно-инженерного инсулина человека представляютсобой стерильный изотонический раствор фармакопейной субстанции инсулина в воде дляинъекций, имеющий рН 6,9—7,8 и концентрацию инсулина 40 или 100 МЕ/мл.

Свойства,методы контроля и нормы готовой лекарственной формы приведены в таблице 2.В качестве консервантов используют фенол, м-крезол и метилпарабен (метиловый эфирп-гидроксибензойной кислоты).По длительности действия готовые лекарственные формы инсулина различаютследующим образом:1) препараты инсулина короткого действия — раствор для подкожного иливнутримышечного применения, начало действия через 30 мин, максимум действия («пик»)через 1-2 ч, общая продолжительность действия 5-8 ч; В РФ применяются Хумулин Регуляр(«Эли Лилли», США), Актрапид НМ («Ново Hopдиск», Дания), Инсуман Рапид («Авентис»,Франция-Германия), Новорапид Аспарт («Ново Hopдиск», Дания), Хумалог Лизпро («ЭлиЛилли», США), Инсуран Р (ИБХ РАН, Россия);2) препараты инсулина пролонгированного действия — суспензия для подкожноговведения, начало действия через 1,5-2 ч, пик через 4-12 ч, общая продолжительностьдействия 18-24 ч.

В РФ применяются Хумулин НПХ («Эли Лилли», США), Протафан НМ(«Ново Нордиск» Дания), Инсуман Базал («Авентис», Франция-Германия), Лантус Гларгин(«Авентис», Франция-Германия), Инсуран НПХ (ИБХ РАН, Россия).18Таблица 2. Спецификация на АФС инсулина человеческого генно-инженерного (ФСП Р N002254/01-110912).[12]№1123№ПоказателиМетод контроляНормы2ОписаниеРастворимость3ВизуальныйГФ XIIПодлиность:ИдентификацияинсулинаВЭЖХ в сравнении состандартом4Белый или почти белый порошокПрактически нерастворим в воде, в спиртеэтиловом 95%, хлороформе, мало растворим в 0,01М растворе кислоты хлористоводородной, 0,01 Mрастворе натра едкогоВремя удерживания основного пика нахроматограмме испытуемого препарата должносоответствовать времени удерживаниястандартного образца инсулина человека (ГСО)Биологический методОФС-42-0009-02Гипогликемическое действие, не менее 27,5 ЕД/мгв пересчете на сухое вещество.Метод пептидногокартирования, ВЭЖХПродукты реакции протеолитическогорасщепления испытуемого препарата истандартного образца должны быть идентичны.Анализ фрагментов проводят методом ВЭЖХРаствор препарата должен быть прозрачным иливыдерживать сравнение с эталонным раствором №1.Раствор препарата должен быть бесцветным иливыдерживать сравнение с эталонным раствором№ 7б.Не более 10,0 %4ПрозрачностьраствораГФ XII5ЦветностьраствораГФ XII6Потери в массепри высушиванииОптическаяплотностьСульфатная золаСодержание цинкаГФ XI789101112131Проинсулинподобная иммунореактивность1Определениеостаточных белковштаммапродуцента1Определениеостаточной ДНКштаммапродуцента1БактериальныеэндотоксиныГФ XIIОт 0,48 до 0,56 в пересчете на сухое вещество придлине волны 276 нм.Не более 2,5 % в пересчете на сухое веществоОт 0,2 % до 1,0 % в пересчете на сухое вещество.ГФ XIIАтомно-абсорбционнаяспектрофотометрияГФ XIIМетод ИФАГФ XIIПредельное содержание не более10 нг/мгМетод ИФАГФ XIIПредельное содержание не более10 нг/мгМетод ПЦРПредельное содержание не более7 нг/мгЛАЛ-тестГФ XIIПредельное содержание не более10 ЕЭ/мг инсулина19Продолжение Таблицы 2.12141516171819202122Содержание А21дезамидо1инсулина и другихродственныхбелковСодержание1высокомолекулярныхбелков1Микробиологическая чистота1Количественноеопределение1Биологическаяактивность1Упаковка34Предельное содержаниеА21-дезамидоинсулина – не более 2%;Предельное содержание других родственныхбелков – не более 2%;ВЭЖХВЭЖХПредельное содержание – не более 1 %Общее число бактерий и грибов менее 100 в 1г препарата при отсутствии семействГФ XIIEnterobacteriaceae,Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus aureus (категория 1.2)ВЭЖХНе менее 27,5 ЕД/мг в пересчете на сухоевеществоНе менее 27,5 ЕД/мг в пересчете на сухоеОФС 42-0009-02веществоПо 50 и 100 г в банки из стекломассы с винтовой горловиной по ГОСТ Р51477-99.Крышку и горловину банки заливают парафином нефтяным по ГОСТ 23683-89,закрывают пергаментом по ГОСТ 1341-97, горловину банки обвязывают суровойниткой, концы заклеивают этикеткой из бумаги писчей по ГОСТ 18510-87.

Характеристики

Список файлов диссертации