Диссертация (1091787), страница 2
Текст из файла (страница 2)
.............................................................................. 971.4. Определение диапазона фрагментов остаточной ДНК в субстанции генно-инженерного инсулиначеловеческого при помощи фосфора Р32. ...................................................................................................... 981.5. Оценка содержания остаточной ДНК в АФС генно-инженерного инсулина человеческого и генноинженерного гистона Н1.3 человеческого при помощи праймеров к ампликонам размером 100 п.о. и198 п.о.
.............................................................................................................................................................. 991.6. Исследование содержания остаточной ДНК штамма-продуцента гистона методом капельнойцифровой ПЦР (кцПЦР) на основе TaqMan проб. Сравнение результатов реакции для разработанного икоммерческого TaqMan зондов..................................................................................................................... 1022. Оценка параметров метода рвПЦР при использовании SYBR GREEN I и технологииTaqMan. Выбор оптимальной методики для рутинного контроля содержания остаточнойДНК штамма-продуцента E.coli в АФС. ....................................................................................... 1063.
Сопоставление показателей разработанной методики рвПЦР на основе SYBR GREEN Iи параметров коммерческого набора фирмы Cygnus Technologies по определениюостаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС генно-инженерного инсулина человекаи генно-инженерного гистона Н1.3 человека. ............................................................................. 1074. Сравнение валидационных характеристик метода ИФА для определения проинсулина вгенно-инженерной субстанции инсулина на основе набора для плазмы крови, ссоответствующими параметрами другого набора, предназначенного для оценкисодержания проинсулина в субстанции инсулина. .................................................................... 109V. ВЫВОДЫ ..............................................................................................................................118VI. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ......................................................................................................................................................119VII.
БЛАГОДАРНОСТИ. .........................................................................................................120VIII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. .............................................................................................1213Список сокращенийПЦР – полимеразная цепная реакция;рвПЦР – полимеразная цепная реакция в реальном времениИФА – иммуноферментный анализ;АФС – активная фармацевтическая субстанция;ОБП – опытное биотехнологическое производство;НХЛ – неходжкинская лимфома;РИА – радиоимунный метод;ЕФ – Европейская Фармакопея;Ф.
США – Фармакопея США;ГФ – государственная фармакопея;СОП – стандартная операционная процедура;ОФС – общая фармакопейная статья;ФСП – фармакопейная статья предприятия;GMP – good manufacturing practice (надлежащая производственная практика);АР – аналог Ритуксимаба;ЭФ – электрофорез;ПААГ – полиакриламидный гель;НАССР - Hazard Analysis and Critical Control Point (Анализ рисков и критические точкиконтроля);ГЛФ – готовая лекарственная форма;FDA – Food and Drug Administration (Управление по санитарному надзору за качествомпищевых продуктов и медикаментов Правительства США);EMA – European Medicines Agency (Европейское агентство лекарственных средств);LLOQ – lower limit of quantification (нижний предел количественного определения);ULOQ – upper limit of quantification (верхний предел количественного определения);ГИФА – гибридизационно-ферментный анализ;WHO – World Health Organization (Всемирная организация здравоохранения);РСО – рабочий стандартный образец;ДНКт – тотальная ДНК;ДНКуз – тотальная ДНК, обработанная ультразвуком;ДНКф – ДНК, обработанная ДНКазой;ВДИ – вода для инъекций;РБ – рекомбинантный белок;4I.
ВВЕДЕНИЕАктуальность работы.Одной из важнейших задач при производстве лекарственных форм, на основе генноинженерных белков, является разработка более совершенных методов контроля качествапродукции. На начальных этапах разработки метода определения содержания примесей вактивнойфармацевтическойсубстанциииспользуюткоммерческиенаборы.Затемразрабатывают более чувствительный и специфичный метод для конкретной технологиипроизводства.
В основу данной работы положена разработка методов рвПЦР и ИФА длявыявления остаточных ДНК и белков штамма продуцента E.coli на примере двух АФСгенно-инженерногоинсулиначеловеческогоигенно-инженерногогистонаН1.3человеческого, с четким подбором компонентов системы и параметров метода для каждогоисследуемого объекта.
Рассматриваемые в данной работе активные фармацевтическиесубстанции являются основой препаратов, крайне важных для лечения сахарного диабета ионкологических заболеваний.Цель данной работы.Целью данной работы является разработка и внедрение метода ПЦР для анализаостаточного содержания ДНК штаммов-продуцентов в активных фармацевтическихсубстанциях, а также внедрение и валидация методики ИФА для анализа остаточных белковштамма-продуцента в биофармацевтических субстанциях.Задачи исследования.1) Разработка метода рвПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli,на примере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулина человеческого и генноинженерного гистона Н1.3 человеческого.2) Оценка параметров метода рвПЦР при использовании интеркалирующего красителяSYBR GREEN I и технологии TaqMan, основанной на введении в реакцию флуоресцентномеченых зондов.
Выбор оптимальной методики для рутинного контроля содержанияостаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС.3) Сопоставление показателей разработанной методики рвПЦР на основе SYBR GREEN Iи параметров коммерческого набора фирмы Cygnus Technologies по определению остаточнойДНК штамма-продуцента E.coli в АФС генно-инженерного инсулина человека и генноинженерного гистона Н1.3 человека.4) Сравнение валидационных характеристик метода ИФА для определения проинсулина вгенно-инженерной субстанции инсулина на основе набора для плазмы крови, с5соответствующими параметрами другого набора, предназначенного для оценки содержанияпроинсулина в субстанции инсулина;5) Применение разработанных методик в контроле качества при производстверекомбинантных белков инсулина и гистона H1.3 на Опытном биотехнологическомпроизводстве ИБХ РАН.Научная новизна работыРазработан высокочувствительный и специфичный метод ПЦР в реальном времени сиспользованием праймеров к фрагменту гена 16S РНК штаммов-продуцентов генноинженерного инсулина и гистона Н1.3 человеческого, с применением интеркалирующегокрасителя SYBR GREEN I и технологии на основе флуоресцентно меченых проб - TaqMan.Рассматриваемый метод имеет несомненное преимущество в сравнении с ПЦР в реальномвремени при использовании праймеров к плазмидной ДНК штамма-продуцента.
Праймеры кплазмидной ДНК не позволяют оценить реальное содержание остаточной тотальной ДНК,поскольку количество геномной ДНК штамма в АФС минимум на порядок превышаетколичество плазмидной ДНК. Это достоверно подтверждено настоящими исследованиями.Показана возможность успешного применения нестандартного набора для ИФА приопределении проинсулина в АФС генно-инженерного инсулина человека. Вышеуказанныйнабор предназначен для определения проинсулина в плазме крови человека. Преимуществоданного набора перед набором прямого назначения, то есть разработанным именно дляопределения проинсулина в АФС инсулина, достоверно подтверждено сравнениемхарактеристик, полученных при валидационных испытаниях для обоих наборов.Практическая значимость работы.Разработанный высокочувствительный и специфичный метод ПЦР в реальном времени, атакже метод ИФА, с применением набора для определения содержания проинсулина вплазме крови, внедрены в технологическое производство и используются для выявленияостаточных ДНК и белков в АФС.
Методы применяют при рутинном анализе в контролекачества при производстве активной фармацевтической субстанции инсулина и гистонаН1.3, а также при оценке рисков и при проведении валидационных испытаний на ОБП ИБХРАН. На основе результатов данных исследований была разработана производственнаядокументация, стандартные операционные процедуры для методик ПЦР, рвПЦР и ИФА.Основные положения, выносимые на защиту.1. Разработка метода рвПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli, напримере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулина человеческого и генноинженерного гистона Н1.3 человеческого.1.1.
Создание рабочего стандартного образца на основе тотальной ДНК штамма-продуцента;61.2. Оптимизация пробоподготовки АФС для определения остаточной ДНК штаммапродуцента методом рвПЦР;1.3. Подбор компонентов и условий проведения реакций рвПЦР с использованием SYBRGREEN I и технологии TaqMan;1.4. Определение диапазона молекулярных масс фрагментов остаточной ДНК в субстанциигенно-инженерного инсулина человеческого при помощи мечения фосфором Р32;1.5. Оценка содержания остаточной ДНК в АФС генно-инженерного инсулина человеческогои генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого при помощи праймеров к фрагменту гена16S РНК E.coli размером 100 п.о.2. Оценка параметров метода рвПЦР при использовании SYBR GREEN I и технологииTaqMan. Выбор оптимальной методики для рутинного контроля содержания остаточнойДНК штамма-продуцента E.coli в АФС.3.
Сопоставление показателей разработанной методики рвПЦР на основе SYBR GREEN I ипараметров коммерческого набора фирмы Cygnus Technologies по определению остаточнойДНК штамма-продуцента E.coli в АФС генно-инженерного инсулина человека и генноинженерного гистона Н1.3 человека.4. Сравнение валидационных характеристик наборов для определения проинсулина методомИФА «Proinsulin ELISA» и «ПанкреоИФА-проинсулин».Публикации и апробации работы.Содержание работы с достаточной полнотой отражено в 3 научных статьях,опубликованныхвследующихжурналах,рекомендуемыхВАК:Биотехнология,Биоорганическая химия, Биофармацевтический журнал (два последних журнала включены вмеждународную базу цитирования SCOPUS); а также в 3 тезисах к международным научнопрактическим конференциям. Результаты работы были представлены на Международномсимпозиуме «Биофарма-2009 от науки к промышленности» (Анталия, Турция, 25-27 мая2009г.), на Международном симпозиуме «Биофарма-2010 от науки к промышленности»(Ереван, Армения, 17-20 мая 2010г), на XIII Международной научно-практическойконференции Inter-Medical «Теоретические и практические аспекты развития научноймысли» (Москва, РФ, 24-25 июля 2015г.).7II.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
