Диссертация (1091787), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Набанку наклеивают этикетку из бумаги писчей по ГОСТ 18510-87 со штриховымкодом (при нанесении штрихового года на отдельную этикетку). Вторичная итранспортная тара в соответствии с ГОСТ 17768-90 и РД-9301-006-05749470-932МаркировкаСоответствует ФСП2Условия храненияСписок Б. Сухое, защищенное от света место, t0 = -100-200C2Срок годности3 годаВ соответствии с требованиями GMP при производстве лекарственных препаратовнеобходим полноценный контроль качества на всех этапах производства активнойфармацевтической субстанции, а также готовых лекарственных форм.2.3.
Белки гистоны, их строение и синтез в клетке.Универсальные компоненты хроматина - белки гистоны, были открыты в 1884 г. А.Косселем. По суммарной массе они сравнимы с ДНК, и их некоторое время считалиносителями генетической информации. Потом им отводили роль регуляторов геннойактивности. Однако оказалось, что огромное разнообразие видов гистонов, на котороеопиралась данная гипотеза, было связано с методом их выделения, приводящим кинтенсивной деградации этих распространенных белков [13].20Гистоны представляют собой небольшие белки основного характера, отличающиесявысокойстепеньюэволюционнойконсервативности.Молекулагистонасодержитглобулярную С-концевую часть и аморфный (не имеющий четко выраженной вторичнойструктуры)N-конец.N-концыгистоноввыступаютзапределыядраимогутвзаимодействовать с другими белками хроматина [14].
По отношению остатков основныхаминокислот (Lys/Arg) гистоны разделяют на пять классов: Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4 (Н - отанглийского "Histone", цифры и буквы обозначают номера фракций при хроматографическойочистке гистонов).Рисунок 5. Общая структура для гистонов H2A, H2B, H3, H4. Три центральные спирали, образующие фолддомен, и свободные концевые участки, подвергаемые различным модификациям [15]Рисунок 6. Гистон H1 соединяется с нуклеосомой ДНК и участвует в образовании 30 нм фибриллы.Присутствует у животных, растений и грибов.
У некоторых архебактерий имеются схожие аналоги [15]21Гистоны Н1 входят в состав нуклеосом, связываясь с линкерной ДНК. При глубокомнуклеазном гидролизе линкерная ДНК отщепляется, что приводит к потере гистона Н1. Онине только регулируют экспрессию и транскрипцию генов, но также играют роль в контролестарения, репарации ДНК и апоптозе, что предполагает важность их содержания в структурехроматина [13]. В дополнение к структурной роли, H1 гистон вовлечен в различныепроцессы, например регуляцию генов и ингибирование репликации хроматина [14].Гистоны найдены в хроматине всех соматических эукариотических клеток, но не былиобнаружены у прокариот.
Их молекулярная масса лежит в пределах от 11 000 до 21000.Гистоны очень богаты основными аминокислотами - аргинином и лизином, на долю которыхприходится до 25% аминокислотных остатков белка. Способность гистонов образовыватькомплексы определяет чрезвычайно важную их функцию в клеточном ядре: формированиенуклеосомного ядра, или кора (от английского "core", сердцевина, ядро) - мультибелковогокомплекса, вокруг которого навивается ДНК [13]. Поскольку боковые (R) группы остатковаргинина и лизина при рН 7 протонированы и потому несут положительный заряд, гистонысоединяются с отрицательно заряженной двухцепочечной ДНК с образованием ДНКгистонового комплекса, который стабилизирован силами электростатического притяжения.Пять основных классов гистонов, найденных во всех эукариотических клетках,различаются по молекулярной массе и аминокислотному составу (таблица 3) [13].Таблица 3.Молекулярная масса и аминокислотный состав гистонов.ГистонМолекулярная массаЛизин, %Аргинин, %Н121000291,5Н2А14500119,5Н2В13700166,5Н3153001013,5Н4113001114Гистон HI - лизин-богатый белок 29% лизина, гистоны Н2А и Н2В содержат много илизина, и аргинина, причем первого больше; гистоны НЗ и Н4 содержат несколько большеаргинина, чем лизина, и относятся к аргинин-богатым белкам.
Аминокислотныепоследовательности гистонов НЗ и Н4 у всех эукариот почти одинаковы, откуда следует, чтооба эти гистона выполняют во всех эукариотических клетках одну и ту же функцию.Сходство аминокислотных последовательностей в случае гистонов H1, H2A и Н2В из разныхэукариотических видов выражено не так сильно. Подтипы гистона H1 показывают болеевысокую межвидовую консервативность, чем внутривидовую, то есть схожесть междучеловеческим гистоном H1.5 и мышиным гистоном H1b (H1.5) выше, чем сходство междучеловеческим гистоном H1.2 и человеческим H1.5 [16].22Значения изоточек для гистонов лежат в интервале рН от 10 до 11 [17].
Структурнаяфункция гистонов связана с формированием нуклеосом, которые имеют большое значениедля компактизации хроматина. Регуляторная функция заключается в обеспечениидифференциальной активности генов и реализуется по нескольким механизмам, наиболееважным из которых является механизм конформационных перестроек нуклеосомныхгистонов при незначительных вариациях физиологических значений рН и ионной силысреды, а также имеющих место при ковалентных модификациях гистонов.2.3.1. Гистоны как основа терапевтических средств.Определенные свойства гистонов, как основных элементов врожденной системызащиты,позволилитерапевтическихпредложитьсредств.ихПоказано,вкачествеосновысовременныхчтогистоныявляютсябелковыхмногофункциональнымсемейством белков [18], и играют главную роль в противодействии различнымпатологическим процессам. К таким процессам относятся: микробная инфекция, коагуляциякрови,септическийшок,аутоиммунныезаболевания,атакжеипрогрессияираспространение злокачественных опухолей [19-22].Тщательное исследование вторичной структуры гистонов показало, что они имеютструктурную гомологию с другими катионными белками и пептидами, например, смагаининами, цекропином и мелиттином, которые известны тем, что формируют каналы вмембране чувствительных клеток, что приводит к их гибели.
При определеннойконфигурации, гистон Н1 формирует комплексы высшего порядка с мембранамиопухолевых клеток, что, в конечном счете, приводит к возникновению каналов и гибелиопухолевой клетки. Образование таких каналов было показано на примере клетокэритролейкоза линии Friend, клеток Т-клеточной линии лейкоза Jukrat и асцитическихопухолевых клеток. Гистон Н1 прочно связывается с искусственными клеточнымимембранами, содержащими анионные фосфолипиды, при этом комплекс гистон Н1фосфолипид включает приблизительно 20 фосфолипидов [23, 24].Эволюционной высоко-консервативной функцией гистона Н1 в иммунной системеноворожденных является распознавание опухолевых клеток, прочное соединение с ихмембраной, проникновение в клеточную мембрану и агрегация с образованием каналов вмембране.
Гистоны обнаружены также в сыворотке и молоке здоровых животных [25].Вероятно, гистон Н1 встраивается в мембрану, сначала связываясь с наружным слоемпри помощи спирали 1 и 3, затем проникая в мембрану при помощи гидрофобных связеймежду гидрофобнойобластьюмембраныиспиралью2. Этопозволяетвторойамфипатической спирали встроиться в промежуток между гидрофильным и гидрофобным23пространствами внутреннего слоя цитоплазматической стороны мембраны, что приводит ктрансмембранному внедрению гистона Н1.
Так как известна способность гистонов колигомеризации, то, скорее всего, после достижения критической концентрации, онисобираются в комплексы внутри мембраны, нарушая тем самым целостность мембраны, чтонеобратимо приводит к лизису клетки. В поддержку этой гипотезы говорит то, что гистоны свысокой аффинностью связываются с отрицательно заряженными фосфолипидами [23, 24],которые, как было показано, в большом количестве находятся в наружном слое некоторыхраковых клеток [26]. В частности, фосфатидилсерин переходит на поверхность мембранопухолевых клеток, подверженных ранним проапоптическим изменениям [27]. Былопоказано также, что гистоны проникают через гематоэнцефалический барьер in vivo путемабсорбционно-опосредованного транспорта [28].При помощи конфокальной микроскопии, было показано, что лейкозные клетки связываютгистон H1.3, меченный флуоресцентным красителем Alexa Fluor® 488. Скопления гистонаH1.3 образуются в мембране раковой клетки, что свидетельствует об олигомеризации белка(рис.7) [29].Рисунок 7 Лейкозные клетки (U973), инкубированные с гистоном H 1.3Гистон H 1.3 помечен красителем Alexa Fluor® 488 (зеленый), ядра контрастированы DAPI (красный) [29]На основе данных I/II фазы клинических исследований препарата «Онкогист»,SYMBIOTEC GMBH (Германия)/TYTONIS BV (Нидерланды) в терапии неходжкинскихлимфом, было подтверждено, что вследствие рассматриваемого механизма цитотоксическоговоздействия на опухолевые клетки не возникает никаких серьезных побочных эффектов.
Всвязи с тем, что гистон является консервативным белком, можно говорить об отсутствиииммуногенности, исключение ксенобиотиков обеспечивает низкую резистентность, что24доказано экспериментально. Мембранные дефекты являются универсальными в раковыхклетках гистологического происхождения: гистоны H1 основе препаратов имеют широкийтерапевтический потенциал не только в лечении рака крови, но и сплошных опухолей [30].Для химиотерапевтического лечения злокачественных опухолей лимфатического типа,или неходжкинских лимфом (НХЛ), предложено использовать препараты на основемоноклональных антител.Моноклональные антитела являются макромолекулами, проявляющими антираковыйэффект внеклеточно и селективно связывающими антиген на поверхности мембранлимфоидных клеток.
Моноклональные антитела для создания препаратов для терапии НХЛмогу быть получены с помощью гибридомной технологии или с помощью технологиирекомбинантных ДНК, как впервые описано в патенте корпорации Genentech, Inc [31].Однако они действуют только на один тип антигенов и являются малоэффективными илинеэффективными по отношению к другим антигенам лимфоидных клеток. Кроме того, такоетерапевтическое лечение имеет ряд недостатков: анафилактические реакции, а такжеосложнения, вызываемые радиоактивными изотопами (чаще всего йода 131 или иттрия 90),которыми мечено моноклональное антитело (ибритумомаб или зевалин, тоситумомаб илибекссар) [32].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
