Диссертация (1091787)
Текст из файла
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯМОСКОВСКОИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖЕНИЕ НАУКИИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКОВМ. М.ШЕМЯКИНА И Ю. А. ОВЧИННИКОВАРОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК_____________________________________________________________________________На правах рукописиКОВАЛЕВА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНАРАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ПЦР И ИФА ДЛЯАНАЛИЗА ОСТАТОЧНОЙ ДНК И БЕЛКОВ ШТАММОВПРОДУЦЕНТОВ В БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЯХ03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)Диссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучный руководительАкадемик РАН, д.х.н., проф. Швец В.И.МОСКВА-2016ОглавлениеСписок сокращений ......................................................................................................................4I. ВВЕДЕНИЕ ...............................................................................................................................5II.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ....................................................................................................81. Введение.............................................................................................................................................. 82.
Обзор научно-технической литературы ....................................................................................... 92.1. Инсулин, строение и синтез в клетке. ....................................................................................................... 92.1.1. Метаболизм глюкозы в организме человека................................................................................... 102.1.2.
Роль инсулина в лечении сахарного диабета .................................................................................. 112.2. Производство генно-инженерного инсулина человека на ОБП ИБХ РАН ......................................... 142.2.1. Перечень основных технологических операций в производстве инсулина................................. 142.2.1.1. Технологические операции, выполняемы в цехе промышленной ферментации ..................... 142.2.1.2. Технологические операции, выполняемые в цехе выделения и очистки ..................................
142.2.1.3 Технологические операции, выполняемые в цехе готовых лекарственных форм .................... 152.2.2. Требования к контролю качества субстанции генно-инженерного инсулина человека ............. 152.3. Белки гистоны, их строение и синтез в клетке. ...................................................................................... 202.3.1.
Гистоны как основа терапевтических средств ............................................................................... 232.4. Разработка биотехнологии получения активной фармацевтической субстанции – аналогаРитуксимаба. .................................................................................................................................................... 262.4.1.
Перечень основных технологических операций в производстве субстанции гистона H1.3. ..... 262.4.1.1. Технологические операции, выполняемы в цехе промышленной ферментации ..................... 262.4.1.2. Технологические операции, выполняемые в цехе выделения и очистки .................................. 272.4.1.3. Контроль качества АФС, физико-химические свойства. ............................................................
272.5. Система управления рисками на производстве генно-инженерных белков. ....................................... 292.6. Общая политика валидации на фармацевтическом производстве ....................................................... 312.6.1. Необходимость валидации аналитических методик ...................................................................... 312.6.2. Валидационные параметры. ............................................................................................................. 322.6.3. Методы анализа, основанные на связывании лигандов ................................................................. 322.7. Методы определения остаточной ДНК и белков штамма-продуцента в активной фармацевтическойсубстанции.
....................................................................................................................................................... 372.8. Метод полимеразной цепной реакции. ................................................................................................... 412.8.1. Основы метода ПЦР.......................................................................................................................... 412.8.2. Детекция проведения амплификации (электрофорез) ...................................................................
462.8.3. ПЦР в режиме реального времени. .................................................................................................. 482.8.3.1. Отличие анализа продуктов ПЦР «по конечной точке» и «в реальном времени». .................. 502.8.3.2. ПЦР в режиме реального времени в качестве диагностического инструмента. ......................
512.8.3.3. Типы ПЦР в режиме реального времени. .................................................................................... 522.8.3.4. Оборудование для ПЦР в реальном времени. ............................................................................. 592.9. Метод иммуноферментного анализа. ...................................................................................................... 612.9.1.
Основы метода ИФА. ........................................................................................................................ 612.9.2. Индикация комплекса антиген-антитело. .......................................................................................
632.9.2.1. Ферменты в качестве меток в иммуноанализе. ........................................................................... 642.9.2.2. Получение конъюгатов для иммуноферментного анализа. ........................................................ 652.9.3. Методы получения антител для ИФА. ............................................................................................ 672.9.4.
Классификация методов иммуноферментного анализа. ................................................................ 682.9.4.1. Схемы методов твердофазного ИФА. .......................................................................................... 702.9.5.
Интерпретация результатов ИФА. ................................................................................................... 74III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...................................................................................771. Объекты исследования .................................................................................................................. 772. Методы исследования .................................................................................................................... 782.1. Определение остаточной ДНК штамма-продуцента в АФС инсулина и гистона Н1.3. .....................
782.1.1. Наращивание биомассы. ................................................................................................................... 782.1.2. Выделение тотальной и плазмидной ДНК. ..................................................................................... 782.1.3. Обработка ДНК ультразвуком, ДНКазой. ....................................................................................... 792.1.4. Пробоподготовка АФС. ....................................................................................................................
7922.1.5. Проведение ПЦР и рвПЦР на основе интеркалирующего красителя SYBR GREEN I итехнологии TaqMan, основанной на введении в реакцию флуоресцентно-меченых зондов. .............. 802.1.6. Подготовка образцов к секвенированию. ....................................................................................... 822.2. Определение содержания проинсулина в АФС инсулина методом ELISA. ........................................
832.2.1. Буфер для проб. ................................................................................................................................. 832.2.2. Пробоподготовка АФС инсулина .................................................................................................... 83IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ....................................................................................841.
Разработка метода рвПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli,на примере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулина человеческого игенно-инженерного гистона Н1.3 человеческого. ......................................................................... 841.1. Создание рабочего стандартного образца на основе тотальной ДНК штамма-продуцента инсулина............................................................................................................................................................................ 841.2. Оптимизация пробоподготовки АФС для определения остаточной ДНК штамма-продуцентаметодом рвПЦР.
............................................................................................................................................... 861.3. Подбор компонентов и условий проведения реакций рвПЦР с использованием SYBR GREEN I итехнологии TaqMan. ........................................................................................................................................ 881.3.1. рвПЦР с использованием SYBR GREEN I. ..................................................................................... 881.3.2. рвПЦР с использованием технологии TaqMan.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
