Диссертация (1091787), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Во время разработки ивалидацииметодаэти«родственныемолекулы»частонедоступны.Оценкуспецифичности можно проводить после завершения первоначальной валидации, когдастановятся доступными дополнительные данные о свойствах аналита. Специфичностьследует оценивать, используя контрольные образцы, добавляя по нарастающейконцентрации имеющихся «родственных молекул» или лекарственных веществ, которые,как ожидается, будут вводиться одновременно, в матрицу образца (предполагается, чтоматрица образца никогда ранее не подвергалась воздействию аналита), а такжепосредством измерения достоверности исследуемой макромолекулы при LLOQ и ULOQ.Критерии приемлемости анализа контрольных образцов должны быть не более 25% отноминальных значений.2.6.3.3.
СелективностьСелективностью метода, основанного на связывании лигандов, является способностьизмерять анализируемое вещество в присутствии не сопутствующих соединений вматрице. Обычно какая-либо экстракция отсутствует, что обусловлено присущимимакромолекуле свойствами.33К тому же не сопутствующие соединения, представленные в матрице, напр., фрагментыферментов, гетерофильные антитела или ревматоидный фактор, могут создавать помехиинтересующему аналиту при использовании метода, основанного на связывании лигандов.Селективность тестируется добавлением аналита к матрице, полученной, как минимум, от10 источников, в концентрации, равной или близкой к LLOQ.
Эти источники должнывключать липидемические или гемолизированные образцы. Также требуется включатьисточники от популяций с соответствующими заболеваниями. Селективность следуетоценивать на нижнем пределе количественного определения метода, когда в большинствеслучаев возникают проблемы. Также возможна оценка селективности при более высокихконцентрациях аналита.
В случаях, когда интерференция зависит от концентрации, важноустановить минимальный порог концентрации, когда интерференция обнаруживается. Довалидации метода лиганд-связывания может понадобиться корректировка нижнегопредела количественного определения в связи с уменьшением минимального порога.Правильность должна находиться в пределах 20% (при LLOQ - 25%) от номинальнойконцентрации, по крайней мере, в 80% оцененных матрицах.2.6.3.4. Эффект переносаЕсли используются автоматизированные системы обработки жидкости, потенциал дляпереноса следует изучить путем анализа образцов «бланк матрицы» после образцов свысокой концентрацией аналита или калибровочного стандарта на верхнем пределеколичественного определения.2.6.3.5.
Выбор матрицыИзмерение некоторых макромолекул может быть невозможно в сложных матрицах безэкстракции ввиду высоких интерференций (больших помех) с высокими уровнямиструктурно связанных эндогенных соединений. Хотя применение экстракционнойматрицы (например, древесного угля, иммунной аффинности) или альтернативнойматрицы(например,протеиновыхбуферов,диализированнойсыворотки)нерекомендуется, использование таких матриц может понадобиться, когда нет альтернативыимеющейся стратегии количественного определения исследуемого аналита. Кривуюкалибровочного стандарта можно приготовить с использованием этих суррогатныхматриц.
Контрольные образцы следует готовить с использованием матриц реальныхобразцов; правильность рассчитывают, демонстрируя отсутствие матричного эффекта.2.6.3.6. Минимально требуемое разведениеНекоторые матрицы могут проявлять высокий фоновый сигнал. Для устранения этогоэффектаможетпонадобитьсяизмерениеминимальнотребуемогоразведения.Минимально требуемое разведение - это наименьшее разведение, до которого необходимо34развести образец в буфере, чтобы оптимизировать правильность и прецизионность в сериианализа путем снижения соотношения сигнал/шум.
Образцы с внесенным количествоманалита следует готовить в той же матрице, что и исследуемые образцы для определенияминимально необходимого разведения.2.6.3.7. Калибровочная криваяФункция отклика калибровочной кривой измеряется опосредованно. Обычно она непоказывает линейности и часто сигмоидальна. Для описания аналитического откликанеобходимоиспользоватькакминимум6калибровочныхстандартовдважды.Концентрацию аналита в калибровочных стандартах устанавливают таким образом, чтобыравномерно распределить их на логарифмической шкале в границах предполагаемогодиапазона. Для более точного описания зависимости аналитического отклика отконцентрации аналита возможно использование «опорных калибраторов», концентрациякоторых выходит за пределы диапазона количественного определения.
При валидацииследует оценивать минимум 6 независимых циклов. Результаты должны бытьпредставлены в таблице для представления общей робастности регрессионной моделикалибровочной кривой. Калибровочный стандарт может быть исключен из данных попричине установленной технической ошибки (напр., ошибка при отмеривании пипеткой).Обратно рассчитанные (back-пересчитанные) концентрации калибровочных стандартовдолжны быть в диапазоне ±20% от номинального значения (±25% при LLOQ и ULOQ), покрайней мере, для 75% калибровочных стандартов.
Для «опорных калибраторов» нетребуются критерии приемлемости, поскольку они находятся за пределами количественнооцениваемого диапазона калибровочной кривой.2.6.3.8. Прецизионность и правильностьДля оценки правильности и прецизионности контрольные образцы должны быть несвежеприготовленными, а должны быть заморожены и обработаны тем же способом, чтои для анализа исследуемых образцов.
Для оценки правильности и прецизионности, атакже полной неопределенности результатов анализа следует использовать, по крайнеймере, 5 контрольных образцов (предполагаемый LLOQ; образец, концентрация которогоменее трехкратного LLOQ; средний; высокий; предполагаемый ULOQ). Валидациядолжнаимитироватьреальныйанализисследуемыхобразцов.Например,еслиисследуемый образец измеряется дважды (т.е. 2-х кратно приготовленный), какрекомендовано, то и во время валидации контрольные образцы следует анализировать иготовить таким же образом. Измерения следует выполнять по всем циклам в течениенескольких дней.
Принимая во внимание внутрисерийную и межсерийную правильность,средняя концентрация должна находиться в диапазоне ±20% от номинального значения на35каждом уровне концентрации (±25% для LLOQ и ULOQ). Внутрисерийная и межсерийнаяпрецизионность должна находиться в диапазоне 20% (25% при LLOQ и ULOQ). Крометого, общая ошибка (т.е. сумма абсолютного значения относительной ошибки в процентахи коэффициента вариации в процентах) не должна превышать 30% (40% при LLOQ иULOQ).2.6.3.9. Линейность при разведенииИз-за узкого диапазона калибровочной кривой при использовании контрольныхобразцов необходимо продемонстрировать, что определяемый аналит, когда присутствуетв концентрациях, превышающих диапазон количественного определения (выше ULOQ),может точно измеряться при количественном анализе после разведения образцом «бланкматрицы» для попадания концентраций аналита в валидированный диапазон для анализа.Дополнительной причиной для проведения экспериментов по разведению являетсяобнаружение возможной прозоны (проагглютинационной зоны) или «хук эффекта» (“hookeffect”), т.е.
подавление сигнала, вызванного высокими концентрациями аналита. Обратнорассчитанная концентрация для каждого разведения должна быть в пределах 20% отноминальной концентрации после поправки на разведение, а прецизионность конечныхконцентраций по всем разведениям не должна превышать 20%.2.6.3.10. ПараллелизмЕсли исследуемые образцы доступны, параллелизм между калибровочной стандартнойкривой и серийно разведенными исследуемыми образцами следует оценивать дляобнаружения возможного матричного эффекта или различной степени сродства кметаболитам. Исследуемый образец с высокой концентрацией аналита (предпочтительноблизкой к максимальной) следует разбавлять, по крайней мере, до трех концентраций«бланком матрицы». Прецизионность между образцами в серии разведений не должнапревышать 30%. В случае, если образец не разводится линейно (т.е.
не параллельно)следует определить процедуру указания результата в отчете. Если исследуемые образцынедоступны во время валидации метода, параллелизм следует оценивать, как толькоисследуемые образцы станут доступными.2.6.3.11. Стабильность образцовСтабильность аналита оценивается с помощью образцов на низком и высокомконцентрационном уровне аналита. Исследование стабильности должно охватыватькратковременную стабильность при комнатной температуре или при температуреобработки образцов, а также стабильности при замораживании/таянии.
Кроме того,долгосрочную стабильность при замораживании следует изучать при каждой температуре,36при которой исследуемые образцы будут храниться. Можно рассмотреть брекетингподход.Средняя концентрация на каждом уровне должна быть в пределах 20% от номинальнойконцентрации. Несоответствие этому критерию следует обосновать.2.6.3.12. РеактивыКритичные реактивы, включая реагенты связывания (напр., связывающие протеины,антитела или конъюгированные антитела), и те, которые содержат ферментативныекомпоненты, оказывают прямое влияние на результаты количественного анализа, ипоэтому необходимо гарантировать их качество.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
