Автореферат (1091785)
Текст из файла
На правах рукописиКОВАЛЕВА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНАРАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ПЦР И ИФА ДЛЯ АНАЛИЗАОСТАТОЧНЫХ ДНК И БЕЛКОВ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ВБИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ СУБСТАНЦИЯХ03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)АВТОРЕФЕРАТДиссертации на соискание ученой степеникандидата химических наукМОСКВА-2016Работа выполнена на кафедре биотехнологии и промышленной фармации Институтатонких химических технологий Федерального государственного бюджетногообразовательного учреждения высшего образования «Московский технологическийуниверситет»ивКонтрольно-аналитическойлабораторииФедеральногогосударственного бюджетного учреждения науки «Институт биоорганической химии им.академиков М.
М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова» РАН.Научный руководитель:академик РАН, доктор химических наук, профессор,Федеральное государственное бюджетноеобразовательное учреждение высшегообразования «Московский технологическийуниверситет»Официальные оппоненты:доктор биологических наук, профессор,начальник отдела биотехнологии и биоэнергетики,Национальный исследовательский центр«Курчатовский институт»кандидат химических наук,старший научный сотрудник,ФГБУ «Федеральный научно-клинический центрфизико-химической медицины ФМБА»Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетноеучреждение наукиШвец Виталий ИвановичВасилов Раиф ГаяновичВарижук Анна МихайловнаИнститут молекулярной генетики РАНЗащита диссертации состоится « 12 » декабря 2016 г.
в 16 ч 30 мин на заседаниидиссертационного совета Д 212.131.06 на базе Федерального государственногобюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московскийтехнологический университет» по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86,ауд. М-119.С авторефератом диссертации можно ознакомиться на Интернет-сайтах ВАК РФhttp://vak.ed.gov.ru и http://mirea.ru.С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Федеральногогосударственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования«Московский технологический университет» по адресу: 119454, Москва, проспектВернадского, д. 78 и на Интернет-сайте http://mirea.ru.Автореферат разослан «»2016 г.Ученый секретарь Диссертационного Совета,кандидат химических наук,старший научный сотрудник2А.И.
Лютик1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1Актуальность работы.Одной из важнейших задач при производстве лекарственных форм на основе генноинженерных белков является разработка более совершенных методов контроля качествапродукции. На начальных этапах разработки метода определения содержания примесей вактивной фармацевтической субстанции используют коммерческие наборы. Затемразрабатывают более чувствительный и специфичный метод для конкретной технологиипроизводства. В основу данной работы положена разработка методов рвПЦР и ИФА длявыявления остаточных ДНК и белков штамма продуцента E.coli на примере двух АФСгенно-инженерного инсулина человеческого и генно-инженерного гистона Н1.3человеческого, с четким подбором компонентов системы и параметров метода длякаждого исследуемого объекта.
Рассматриваемые в данной работе активныефармацевтические субстанции являются основой препаратов, крайне важных для лечениясахарного диабета и онкологических заболеваний.Цель работы.Целью данной работы является разработка и внедрение в биотехнологическоепроизводство метода ПЦР для анализа остаточного содержания ДНК штаммовпродуцентов в активных фармацевтических субстанциях, а также внедрение и валидацияметодикиИФАдляанализаостаточныхбелковштамма-продуцентавбиофармацевтических субстанциях.Задачи исследования.1) Разработка метода рвПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцентаE.coli, на примере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулиначеловеческого и генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого.2) Оценка параметров метода рвПЦР при использовании интеркалирующего красителяSYBR GREEN I и технологии TaqMan, основанной на введении в реакциюфлуоресцентно-меченых зондов.
Выбор оптимальной методики для рутинного контролясодержания остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС.3) Сопоставление показателей разработанной методики рвПЦР на основе SYBRGREEN I и параметров коммерческого набора фирмы Cygnus Technologies поопределению остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС генно-инженерногоинсулина человека и генно-инженерного гистона Н1.3 человека.31В руководстве работой принимала участие к.х.н. Шибанова Елена Дмитриевна.Список сокращений: АФС – активная фармацевтическая субстанция, ПЦР – полимеразная цепная реакция,рвПЦР – полимеразная цепная реакция в реальном времени, ИФА – иммуноферментный анализ, ОБП –Опытное биотехнологическое производство; ФСП – фармацевтическая статья предприятия, РСО – рабочийстандартный образец, ЕФ – Европейская Фармакопея, FDA - Food and Drug Administration (Управление посанитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов Правительства США); ICH –International Conference on Harmonization (Международная конференция по гармонизации), WHO – WorldHealth Organization (Всемирная организация здравоохранения); ДНКт – тотальная ДНК, ДНКуз – тотальнаяДНК, обработанная ультразвуком, ДНКф – тотальная ДНК, обработанная ДНКазой, РБ – рекомбинантныйбелок, ГЛФ – готовая лекарственная форма.4) Сравнение валидационных характеристик метода ИФА для определенияпроинсулина в генно-инженерной субстанции инсулина на основе набора для плазмыкрови, с соответствующими параметрами другого набора, предназначенного для оценкисодержания проинсулина в субстанции инсулина;5) Применение разработанных методик в контроле качества при производстверекомбинантных белков инсулина и гистона H1.3 на Опытном биотехнологическомпроизводстве ИБХ РАН.Научная новизна работы.Разработан высокочувствительный и специфичный метод ПЦР в реальном времени сиспользованием праймеров к фрагменту гена 16S РНК штаммов-продуцентов генноинженерного инсулина и гистона Н1.3 человеческого, с применением интеркалирующегокрасителя SYBR GREEN I и технологии на основе флуоресцентно меченных проб TaqMan.
Рассматриваемый метод имеет несомненное преимущество в сравнении с ПЦР вреальном времени при использовании праймеров к плазмидной ДНК штамма-продуцента.Праймеры к плазмидной ДНК не позволяют оценить реальное содержание остаточнойтотальной ДНК, поскольку количество геномной ДНК штамма в АФС минимум напорядок превышает количество плазмидной ДНК.
Это достоверно подтвержденонастоящими исследованиями.Показана возможность успешного применения нестандартного набора для ИФА приопределении проинсулина в АФС генно-инженерного инсулина человека.Вышеуказанный набор предназначен для определения проинсулина в плазме кровичеловека. Преимущество данного набора перед набором прямого назначения, то естьразработанным именно для определения проинсулина в АФС инсулина, достоверноподтверждено сравнением характеристик, полученных при валидационных испытанияхдля обоих наборов.Практическая значимость работы.Разработанный высокочувствительный и специфичный метод ПЦР в реальномвремени, а также метод ИФА, с применением набора для определения содержанияпроинсулина в плазме крови, успешно внедрены в технологическое производство ииспользуются для выявления остаточных ДНК и белков в АФС на ОБП ИБХ РАН.Методы применяют при контроле качества активной фармацевтической субстанцииинсулина и гистона Н1.3, а также при оценке рисков и при проведении валидационныхиспытаний.
На основе результатов данных исследований была разработанапроизводственная документация, стандартные операционные процедуры для методикПЦР, рвПЦР и ИФА.Основные положения, выносимые на защиту.1. Разработка метода рвПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli,на примере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулина человеческого игенно-инженерного гистона Н1.3 человеческого.42. Оценка параметров метода рвПЦР при использовании SYBR GREEN I и технологииTaqMan. Выбор оптимальной методики для рутинного контроля содержания остаточнойДНК штамма-продуцента E.coli в АФС.3. Сопоставление показателей разработанной методики рвПЦР на основе SYBR GREEN Iи параметров коммерческого набора фирмы Cygnus Technologies по определениюостаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС генно-инженерного инсулина человекаи генно-инженерного гистона Н1.3 человека.4.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
