Автореферат (1091785), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Сравнение валидационных характеристик наборов для определения проинсулинаметодом ИФА «Proinsulin ELISA» и «ПанкреоИФА-проинсулин».Публикации и апробации работы.Содержание работы с достаточной полнотой отражено в 3 научных статьях,опубликованных в следующих журналах, рекомендуемых ВАК: Биотехнология,Биоорганическая химия, Биофармацевтический журнал (два последних журналавключены в международную базу цитирования SCOPUS); а также в 3 тезисах кмеждународным научно-практическим конференциям. Результаты работы былипредставлены на Международном симпозиуме «Биофарма-2009 от науки кпромышленности» (Анталия, Турция, 25-27 мая 2009г.), на Международном симпозиуме«Биофарма-2010 от науки к промышленности» (Ереван, Армения, 17-20 мая 2010г), наXIII Международной научно-практической конференции Inter-Medical «Теоретические ипрактические аспекты развития научной мысли» (Москва, РФ, 24-25 июля 2015г.).Структура и объем работы.Диссертационная работа изложена на 128 страницах машинописного текста.
Состоит извведения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и обсуждения,выводов, списка публикаций, списка литературы, включающего 106 источников. Работасодержит 59 рисунков и 17 таблиц.2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫI. ВведениеВо введении обоснована актуальность выбранной темы, сформулированы цель и задачиисследования, раскрыты научная новизна и практическая значимость работы, указаноколичество публикаций и апробаций исследовательской работы.II.
Литературный обзорОбзор литературы состоит из двух разделов. Первый – введение, в которомрассказывается о необходимости развития современных чувствительных методовопределения специфических примесей в АФС. Во втором разделе описанотерапевтическое действие человеческих генно-инженерных инсулина и гистона Н1.3,контроль показателей качества АФС данных препаратов, принципы валидациианалитических методик. В заключительных главах описаны типы ПЦР, а также основныеподходы метода ИФА.5III.
Экспериментальная частьОбъекты исследованияВ качестве объекта исследований были выбраны 28 серий АФС генно-инженерногоинсулина человеческого и 23 серии АФС генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого,6 серий рекомбинантного инсулина Аспарт, 6 серий рекомбинантного инсулина Гларгин,полученные на ОБП ИБХ РАН. Для выделения тотальной ДНК были использованыштаммы-продуценты инсулина E.Coli BL21(DE3)/pINS07 - Патент №2267534, инсулинаАспарт E.Coli BL21/pAS-2 (BAS2) - Патент №2337964, инсулина Гларгин E.ColiBL21/pGG-1(BGG18) - Патент №2325440, разработчик штаммов ИБХ РАН, депонированыв музее штаммов-продуцентов ОБП ИБХ РАН), гистона Н1.3 E.coli BL21/prhH1.3(получен от ЗАО «Крионикс», РФ), а также высокопродуктивной стабильной клеточнойлинииhuFSHIK,секретирующейрекомбинантныйчеловеческийФСГ(фолликулостимулирующий гормон), на основе линии СНО К1 DXB11 (№2012106207,разработчики ООО «Фармако Биотех», ООО «Фармбиотех», ИБХ РАН), Pichia pastorisYeast Strain GS115 (#C181-00, Invitrogen).
Коммерческие наборы: для рвПЦР DNAExtraction and Amplification Kit for the Measurement of Residual E.coli Host Cell DNA(#D415T, Cygnus Technologies), Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)(ThermoScientific, США), для кцПЦР ddPCR Supermix for residual DNA Quantificaton (#1864037,BIO-RAD, США), праймеры и флуоресцентные пробы One-Step RT-ddPCR Kit for Probes(#1863021, BIO-RAD, США), для ИФА «Proinsulin ELISA» (#EIA-1560, DRGInstrumentGmbH, Германия) и «ПанкреоИФА-проинсулин» (ЗАО «АлкорБио», Россия).Условия амплификации: Программа 1: 95ºС 5 мин; 35 циклов: 95ºС 30 сек, 50ºС-70ºС30 сек; 72ºС 20 сек.
Затем 72ºС 3 мин. Программа 2: 95ºС 5 мин; 45 циклов: 95ºС 30 сек,60ºС 60 сек. Программа 3: 95ºС 5 мин; 45 циклов: 95ºС 30 сек, 58ºС 40 сек. Программа 4:95 ºС 10 мин, 95 ºС 15 сек, 54 ºС 1 мин, 40 циклов, финальная стадия 98 ºС 10 мин.Праймеры для ампликонов размером: 252 п.о.: Blaf-534 5’-GAT GCT TTT CTG TGACTG GTG-3’; Blaref-765 5’- ACG CTG GTG AAA GTA AAA GAT-3’. 79 п.о.: 16S-FN 5'GGG ATA ACT ACT GGA AAC GGT -3'; 16S-REWnew 5' - ATG GGC AAG AGG CCCGAA - 3'. 123 п.о.: 16S-FORW 5' - GTG GCG GAC GGG TGA GTA - 3'; 16S-REWnew 5' ATG GGC AAG AGG CCC GAA - 3'.
179 п.о.: 16S-FORWnew 5' - CCT AAC ACA TGCAAT GTC GAA - 3'; 16S-REWnew 5' - ATG GGC AAG AGG CCC GAA - 3'. 425 п.о.: 16SFORW 5' - GTG GCG GAC GGG TGA GTA - 3'; 16Sa-REW 5'- GGC TGC TGG CAC GGAGTT -3'. 911п.о.: 16S-FN 5'- GGG ATA ACT ACT GGA AAC GGT -3'; 16S-RN 5'- CATGCA GCA CCT GTC TCA CA -3'. 198 п.о.: 16S-FORWnew(1) 5' – CCT AAC ACA TGC AAGTC GAA C- 3'; 16S-REWnew(1) 5' – AAT CCC ATC TGG GCA CAT CC – 3'.
100 п.о.:16S-FN 5'- GGG ATA ACT ACT GGA AAC GGT -3'; 16S-REWnew(1) 5' – AAT CCC ATCTGG GCA CAT CC – 3'.TaqMan зонды: 16S-RealTime(1) 5' R6G- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA –BHQ2 - 3'; 16S-RealTime(2) 5' FAM- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA – RTQ1 3'; 16S-RealTime(3) 5' FAM- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA – BHQ1 - 3'; 16S6RealTime(4) 5' FAM- CTA ATA CCG CAT(BHQ1) AAC GTC GCA AGA - 3'; 16SRealTime(5) 5' FAM - ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA CCA AAG- BHQ1 - 3'.IV.
Результаты и обсуждение.1. Разработка метода рвПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцентаE.coli, на примере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулиначеловеческого и генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого.Для контроля степени чистоты и качества АФС необходимо развитие современныхчувствительных методов определения специфических примесей, таких как остаточныебелки и ДНК штаммов-продуцентов. Количество ДНК в АФС, предназначенных дляпроизводства инъекционных препаратов не должно превышать 10 нг на терапевтическуюдозу, согласно требованиям руководств ЕФ, FDA, ICH и WHO, а также согласно ФСП РN002254/01-081209. Соответственно, не более 7-10 нг на 1 мг сухого вещества (7-10 ppm)для генно-инженерного инсулина.
Для рекомбинантного гистона Н1.3 это значениесоставляет не более 5 пг на 1 мг сухого вещества (5 ppb). Далее подробно изложеныосновные этапы исследования.1.1. Создание рабочего стандартного образца на основе тотальной ДНК штаммапродуцента инсулина.Вследствие прохождения выделяемым продуктом множества технологических стадий,остаточная ДНК штамма-продуцента, присутствующая в фармацевтической субстанции,является гетерогенным материалом. Это «обрывки», фрагменты одно- и двухцепочечнойДНК, образовавшиеся в результате проведения технологического процесса, начиная отразрушения клеток штамма-продуцента до финишной очистки получаемого продукта. Сцелью создания рабочего стандартного образца (РСО) для метода рвПЦР тотальную ДНКштамма-продуцента инсулина (ДНКт) обработали ультразвуком в течение 10 мин, такжепараллельно тотальную ДНК инкубировали с ДНКазой I при 37 ºС в течение 15 мин (1,5ед. ДНКазы на 1 мкг ДНКт).
Затем результаты визуализировали при помощи Дотблоттинга (рис 1А), а также оценивали степень разрушения ДНК при помощигоризонтального агарозного электрофореза (рис.1В). Для штамма-продуцента гистонабыли получены идентичные результаты. Размер ДНКт составил 2000-3000 п.о., ДНКуз 80600 п.о., ДНКф не удалось визуализировать вследствие ее сильной фрагментации.Рисунок 1. А) Метод гибридизации (Дот-блот). На нейлоновую мембрану и в реакционную смесь для ПЦРвносили одинаковое количество ДНКт, ДНКуз и ДНКф штамма-продуцента инсулина – 10 нг, 3 нг, 1 нг, 0,3нг и 0,1 нг. В) Электрофоретический анализ в 1,5% агарозном геле 2 нг ДНК инсулина в присутствии этидиябромида: 1 – Маркер молекулярных весов; 2 – ДНКт; 3- ДНКуз (10 мин обработки ультразвуком); 4 – ДНКф.71.2.
Оптимизация пробоподготовки АФС для определения остаточной ДНК штаммапродуцента методом рвПЦР.Для образцов АФС инсулина пробоподготовка сводится к получению растворасубстанции в 10–20 мМ Трис-HCl буфере рН 7,0–8,0. Причем чувствительность методарвПЦР позволяет использовать раствор с низкой концентрацией тестируемой субстанции(до 10 мкг/мл), что особенно хорошо для препаратов генно-инженерных белков, склонныхк агрегации и выпадению в осадок в отсутствие стабилизирующих веществ (детергентов,консервантов и др.). Это является явным преимуществом применения метода рвПЦР дляАФС.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
