Автореферат (1091785), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Для исследованных серий эти значения были в диапазоне от 160 до 800 фгдля 10 мкг АФС гистона Н1.3 (от 16 до 80 ppb). Сводные данные для серии 381212 АФСгистона Н1.3 представлены на рисунке 7 и в таблице 3.Рисунок 7. рвПЦР (SYBR GREEN I). А) Метод добавок. Графики накопления ДНКуз для ампликона 425п.о., программа 2;1 - ДНК, выделенная из трипсинолизированного гистона Н1.3 (количество белка 10 мкг вреакции) + ДНКуз 50 фг в реакции; 2 - ДНК, выделенная из трипсинолизированного гистона Н1.3(количество белка 10 мкг в реакции);3 – ДНКуз 50 фг в реакции. В) Кривые плавления продуктовамплификации.Таблица 3.
Метод добавок. Результаты рвПЦР (SYBR GREEN I) по программе 2, размер ампликона 425 п.о.НаименованиеЧисло цикловРасчетная концентрация остаточной ДНК,фг по уравнению калибровкиY= -3,3722x+37,339;R2=0,9921ДНКуз гистона Н1.3 50 фг31,553,727,6770,127,5824,5ДНК, выделенная из 10 мкгтрипсинолизированной субстанциигистона Н1.3ДНК, выделенная из 10 мкгтрипсинолизированной субстанциигистона Н1.3 + ДНКуз гистонаН1.3 50 фгТемпература плавления продуктов рвПЦР для ДНКуз 83,1°С соответствовалаампликону 425 п.о., этот показатель в случае АФС и АФС+ДНКуз составлял около 79,0°С.
Электрофоретический анализ в агарозном геле в присутствии SYBR GREEN I (рис. 8)показал, что случае РСО полоса на электрофореграмме соответствовала ампликонуразмером 425 п.о. В образцах АФС гистона Н1.3 имела место амплификация продуктабольшего по размеру. В случае АФС инсулина кривая плавления продуктов реакциитакже имела пик в области 79,0 °С.13Рисунок 8. Электрофореграмма в 5% агарозном геле продуктов амплификации фрагмента 425 п.о. вприсутствии SYBR GREEN I. Программа 2.
Метод добавок, концентрации в реакции: 1 – вода; 2 - ДНК,выделенная набором Cygnus из 10 мкг трипсинолизированной АФС гистона Н1.3; 3 - ДНК, выделеннаянабором Cygnus из 10 мкг трипсинолизированной АФС гистона Н1.3 + ДНК гистона Н1.3 50 фг; 4- ДНКгистона Н1.3 50 фг; 5 – Маркер молекулярных весов.Для устранения возможности образования шпилек и других пространственныхструктур ДНК в реакцию ввели 3% ДМСО, что повысило эффективность реакции, этоможно судить по S-образности кривой накопления амплификата (рис.9А). Вследствиедобавления ДМСО температура плавления всех продуктов понизилась на 4 градуса. ДляДНКуз для ампликона 425 п.о. составляла 79,0°С, этот показатель в случае АФС иАФС+ДНКуз имел значение около 75,5 °С (рис.9В).
Электрофоретическая картина былааналогична рисунку 8.Рисунок 9. рвПЦР (SYBR GREEN I) А) Метод добавок. Графики накопления ДНКуз гистона Н1.3 дляампликона 425 п.о., программа 2; 1,2 - ДНК, выделенная из трипсинолизированного гистона (количествобелка 10 мкг в реакции) + ДНКуз 50 фг в реакции; 3,4 - ДНК, выделенная из трипсинолизированногогистона (количество белка 10 мкг в реакции);5,6 – ДНКуз 50 фг в реакции.
В реакции 1,3,5 добавлено 3%ДМСО. В) Кривые плавления продуктов амплификации.Провели секвенирование двух продуктов рассматриваемой реакции. Результатыоценили при помощи программы Sequencing Analysis 5.2.0., что выявило наличие а АФСгистона Н1.3 двух продуктов ПЦР реакции, один из которых соответствовал контролю ампликону 425 п.о., природа второго продукта была неизвестна. Наличиедополнительного продукта в АФС гистона Н1.3 объясняет превышение содержанияостаточной ДНК в сравнении с контролем (табл.3). Провели оценку стабильности геномаштамма-продуцента гистона Н1.3 путем отбора проб для рвПЦР в контрольных точках:посевной материал, биомасса после ферментации, АФС гистона Н1.3, ГЛФ препаратОнкогист (серии 041012, 220912, 381212). Данные рвПЦР представлены в таблице 4.Дополнительный продукт отсутствовал в посевном материале и в биомассе, что говорит очистоте клеточной культуры.
При этом неспецифический пик был только в АФС гистона14Н1.3 и отсутствовал в ГЛФ. Количество остаточной ДНК штамма-продуцента гистонаН1.3. в ГЛФ составило 4,8 ppb (серия 041012), 4,2 ppb (серия 220912), 4,8 ppb (серия281212), что соответствует нормативным требованиям. Аналогичный эксперимент былпроведен для штамма-продуцента инсулина, в качестве ГЛФ использовали препаратыИнсуран Р (серия 010413), Инсулин гларгин (серия 020615), Инсулин аспарт (серия080515). В отношении неспецифического пика получили идентичные результаты.Таблица 4. Оценка пиков на кривых плавления рвПЦР с использованием SYBR GREEN IНаименованиеНаличие основного пика наНаличие пика на кривыхкривых плавления продуктоврвПЦР пика в области 83,1°Сплавления продуктов рвПЦРпика в области 79,0°СПосевной материалв наличииотсутствуетБиомасса после ферментациив наличииотсутствуетАФС гистона Н1.3отсутствуетв наличииГЛФ препарат Онкогиств наличииотсутствуетАнализ последовательности второго продукта (максимум пика на кривой плавленияпродуктов рвПЦР 79 ºС) в АФС при помощи базы данных BLAST выявил 75-80%совпадение обнаруженной последовательности с геном 16S РНК ряда микроорганизмов:Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Lactobacillus casei,Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Staphylococcus epidermidis, Rhodobacter sphaeroides,которые периодически присутствуют в воздухе на поверхности рабочей зоны на этапахочистки рекомбинантного белка.
Это подтверждают данные анализа микробиологическойчистоты воздуха рабочей зоны аспирационным и седиментационным методами. Такимобразом, праймеры к ампликону 425 п.о. предоставляют дополнительную информацию одопустимой микробной контаминации рабочей зоны, но не дают корректного сравненияиспытуемой пробы с контролем. Что требует дальнейшей разработки метода рвПЦР.Стерильная фильтрация на стадии приготовления ГЛФ устраняет допустимую микробнуюконтаминацию АФС, что подтверждает отсутствие неспецифического пика в ГЛФ (табл.4).Поскольку интеркалирующий краситель SYBR Green I связывается с любымидвухцепочечными ДНК, в том числе и димерами праймеров, с целью преодолениянедостатков оптимизируемой реакции и для повышения чувствительности системырвПЦР было предложено использование метода со специфической системой детекции(TaqMan).
Основными преимуществами метода TaqMan, относительно SYBR GREENявляется возможность проведения нескольких реакций в одной смеси (напримеродновременное определение содержания плазмидной и геномной ДНК штаммапродуцента в АФС), меньший риск контаминации, большая точность при малыхколичествах субстрата. Были разработаны линейно-разрушаемые пробы, которые вводилив реакцию с исследуемыми праймерами к геномной ДНК штамма-продуцента.Наибольшую чувствительность система имела при использовании флуоресцентныхзондов 16S-RealTime(5), 16S-RealTime(1) и 16S-RealTime(3) (рис.10).
Проводилась15оптимизация рвПЦР по следующим параметрам: концентрация праймеров к ампликону179 п.о. и зондов в реакции, время и температура отжига.Рисунок 10. рвПЦР (TaqMan). Графики накопления 50 фг ДНКуз гистона Н1.3 для ампликона 179 п.о.,программа 3; 1 – зонд 16S-RealTime(5) 5' FAM - ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA CCA AAG- BHQ1 - 3';2 – зонд 16S-RealTime(1) 5' R6G- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA – BHQ2 - 3'; 3 – зонд 16SRealTime(3) 5' FAM- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA – BHQ1 - 3'.При этом данные количественного определения остаточной ДНК в АФС инсулина и гистонаН1.3, определяемые рвПЦР TaqMan, были сопоставимы с данными на основе рвПЦР сиспользованием SYBR GREEN I. рвПЦР для ДНКуз гистона Н1.3 с использованием TaqManзондов при размере ампликона 179 п.о. демонстрирует значение порогового цикла флуоресценции34 цикла (зонд 16S-RealTime(5)) при положительном контроле 50 фг ДНКуз гистона Н1.3. ДлярвПЦР с SYBR GREEN I значение указанного выше параметра составляет 35,3 цикла.1.4.
Определение диапазона фрагментов остаточной ДНК в субстанции генноинженерного инсулина человеческого при помощи фосфора Р32.На следующем этапе выявили, в каком виде остаточная ДНК штамма-продуцентаE.coli представлена в АФС после прохождения продуктом всех стадий технологическогопроцесса. Анализ меченой фосфором Р32 ДНК, выделенной из 1 мг АФС инсулина, в 12 %ПААГ показал, что 80-90% ДНК имеет размер 80-250 п.о. (рис. 11).
И это ожидаемыйрезультат, поскольку в процессе получения биофармацевтических продуктов основноевоздействие на структуру ДНК клетки-хозяина могут оказывать процессы разрушенияклеток обработкой ультразвуком или давлением, а так же последующая фрагментацияудаление ДНК с использованием ДНКазы. ДНКуз имеет диапазон длин фрагментов от 80до 600 п.о., ДНК, меченая 32Р и обработанная ДНКазой - ДНКф от 80 до 150 п.о.
имеетразмер 50-150 п.о.300 п.о.200 п.о.80-250 п.о.100 п.о.1 2 3Рисунок 11. Электрофорез в 12% ПААГ тотальной ДНК штамма-продуцента инсулина, меченной 32P:1 – тотальная ДНК штамма-продуцента инсулина, обработанная ДНКазой (ДНКф); 2 - тотальная ДНКштамма-продуцента инсулина, обработанная ультразвуком (ДНКуз); 3 - остаточная ДНК штаммапродуцента инсулина, выделенная из субстанции инсулина (ДНКс).16Вследствие низкомолекулярного диапазона фрагментов остаточной ДНК в АФСинсулина, для дальнейших исследований сделали выбор в пользу ампликонов размером от80 до 250 п.о.1.5.
Оценка содержания остаточной ДНК в АФС генно-инженерного инсулиначеловеческого и генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого при помощипраймеров к ампликону размером 100 п.о.Были разработаны праймеры к фрагменту гена 16S РНК E.coli, с размером ампликонов100 и 198 п.о. Температуры отжига для прямого и обратного праймеров каждогоампликона абсолютно идентичны, что дополнительно повышает эффективность рвПЦР.Небольшойразмерампликоновпозволяетпроводитьидентификациювнизкомолекулярном диапазоне фрагментов остаточной ДНК E.coli.
На первом этапепровели ПЦР в диапазоне температур отжига от 50°С до 70°С, затем результатывизуализировали при помощи электрофореза в 1,5 % агарозном геле. Это позволиловыбрать оптимальные температуры отжига для каждой пары праймеров. Ампликон 100п.о. показал большую чувствительность, в сравнении с ампликоном 198 п.о. На рисунке 12представлены данные рвПЦР для разработанных праймеров к ампликону размером 100п.о. При этом С(t) для ДНКуз инсулина в количестве 70 пг в реакции составил 18,8, тогдакак этот показатель для ДНКуз гистона Н1.3 в количестве 50 фг в реакции составил 32,0(рис. 12А). Что сопоставимо с соответствующими величинами для ампликона 425 п.о.Кривые плавления указывают на отсутствие димеров праймеров (рис.
12В). Данные посодержанию остаточной ДНК в АФС инсулина при использовании праймеров кампликонам размером 100 п.о. и 179 п.о. представлены в таблице 5. Пики на кривыхплавления АФС и контроля были одинаковы и соответствовали ампликону размером 100п.о.Рисунок 12. рвПЦР (SYBR GREEN I). А) Графики накопления: ДНКуз инсулина – 70 пг/в реакции (1);ДНКуз гистона Н1.3 – 50 фг в реакции (2). рвПЦР (SYBR GREEN I), программа 3, праймеры к ампликону100 п.о., 50 фг ДНКт и ДНКуз в реакции.
В) Кривые плавления продуктов амплификации. Тпл 100 п.о. около81,5°С.Таблица 5. Содержание остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС инсулинаИсследуемыйобъектСерия061112АФС инсулина091112Размер ампликона,п.о.Содержание остаточной ДНК штаммапродуцента E.coli, ppm1006,11791,521005,91791,517Для гистона Н1.3 серии 381212 этот показатель составил 4,8 ppb, что соответствуетколичеству остаточной ДНК в ГЛФ препарате Онкогист (праймеры к ампликону 425 п.о.).Таким образом, был успешно разработан высокочувствительный и специфичный методрвПЦР с праймерами к ампликону 100 п.о. для определения остаточной ДНК в АФСинсулина и гистона Н1.3.2. Оценка параметров метода рвПЦР при использовании SYBR GREEN I итехнологии TaqMan. Выбор оптимальной методики для рутинного контролясодержания остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС.Проведенные исследования показали, что чувствительность разработанных методикрвПЦР с использованием SYBR GREEN I и технологии TaqMan сопоставимы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
