Автореферат (1091785), страница 3
Текст из файла (страница 3)
При оценке количественного содержания ДНК в исследуемом образце пополученным калибровочным кривым РСО необходимо убедиться, что эффективностьрвПЦР для РСО и искомой ДНК примерно одинаковы. Для этого использовали методдобавок, в образцы субстанции инсулина серий 110908, 050209 (образец 1 и 2),содержащие 10 мкг белка, было внесено по 70 пг ДНКуз (рис.2). Сопоставлениеполученных данных по определению ДНК в образцах с добавлением известных количествстандартных растворов плазмидной и геномной ДНК, обработанных ультразвуком, далосовпадающие результаты. Следовательно, наличие большого количества белка или другихингредиентов в пробе не препятствует количественному определению ДНК в АФСинсулина.
То есть предложенный метод не требует предварительной пробоподготовки иее стандартизации для получения достоверного результата.Рисунок 2. Электрофореграмма в 1,5% агарозном геле продуктов рвПЦР в присутствии SYBR GREEN I .Метод добавок рвПЦР, праймеры к плазмидной ДНК, программа 1 при температуре отжига 58ºС, 45 циклов:1;2 – вода; 3;4 – АФС инсулина 10 мкг, серии 110908, 050209 соответственно; 5;6 - АФС инсулина 10 мкг,серии 110908, 050209 соответственно + ДНКуз инсулина 70 пг; 7;8 – ДНКуз инсулина 70 пг; 9 – маркермолекулярных весов.Особенность строения гистонов обуславливает формирование их прочного комплекса смолекулами ДНК. Что затрудняет анализ содержания остаточной ДНК штаммапродуцента в АФС.
Поэтому для определения количеств ДНК порядка 10-12-10-15гнеобходима высокая чувствительность методики и особая пробоподготовка для АФСгистона Н1.3. Применение набора Cygnus для экстракции ДНК из субстанции гистонаН1.3 не дало нужного результата. В ходе выделения комплекс ДНК-белок оставался внеизменном виде, при этом реакция ПЦР не протекала, вследствие отсутствия свободногосубстрата ДНК в реакционной смеси (рис.
3А). Комплекс разрушили при помощигидролиза АФС трипсином. Соотношение фермент:белок составило 1:100. Результаты8трипсинолиза оценили при помощи электрофореза в ПААГ по Лэммли в денатурирующихусловиях (рис. 3В).В)А)Рисунок 3. А) Электрофореграмма в 2,5% агарозном геле продуктов ПЦР для фрагмента 425 п.о. вприсутствии этидия бромида. Программа 2. Метод добавок, концентрации в реакции: 1 – вода; 2 – ДНК,выделенная набором Cygnus из 10 мкг АФС гистона Н1.3; 3- ДНК гистона Н1.3 50 фг; 4 - ДНК, выделеннаянабором Cygnus из 10 мкг АФС гистона Н1.3 + ДНК гистона Н1.3 50 фг; 5 - ДНК, выделенная наборомCygnus из 10 мкг трипсинолизированной АФС гистона Н1.3; 6 - ДНК, выделенная набором Cygnus из 10 мкгтрипсинолизированной АФС гистона Н1.3 + ДНК гистона Н1.3 50 фг; 7 - ДНКт гистона Н1.3 2 нг.
В)Электрофореграмма в 12% ПААГ АФС гистона Н1.3 до и после трипсинолиза: 1 – Гистон Н1.3 4 мкг; 2,3,4 –Гистон Н13. после обработки трипсином в течение 1,2,4 часов соответственно, 40 мкг АФС.На последующем этапе пробоподготовки из трипсинолизированной субстанциивыделили ДНК при помощи набора Cygnus. Для подтверждения оптимальности методапробоподготовки использовали метод добавок для ПЦР. В пробирки вносили 10 мкг АФСгистона Н1.3; ДНК, экстрагированную при помощи набора Cygnus из АФС, а также ДНК,экстрагированную при помощи набора Cygnus из трипсинолизированной АФС.
Квышеуказанным субстанциям добавляли 50 фг тотальной ДНК (ДНКт) гистона Н1.3 (рис.3А). Метод добавок показал оптимальность этапов пробоподготовки, при использованиистадии трипсинолиза.1.3. Подбор компонентов и условий проведения реакций рвПЦР с использованиемSYBR GREEN I и технологии TaqMan.Применение ПЦР и рвПЦР позволяют выявлять одно- и двухцепочечные фрагментыДНК размером равным и большим выбранному для амплификации фрагменту. Ранее вОБП ИБХ РАН был разработан метод рвПЦР по количественному определенииюплазмидной ДНК в АФС инсулина. С применением праймеров к гену β-лактамазы (bla-генустойчивости к ампициллину), проводили амплификацию нуклеотидного фрагментаразмером 252 п.о.
Для разработки праймеров был выбран консервативный фрагмент гена16S РНК E.coli размером 1000 п.о. При помощи пакета программ Vector NTI Advance11.5.1 разработали праймеры к фрагментам гена 16S РНК E.coli размером 79 п.о, 123 п.о,179 п.о., 425 п.о., 911 п.о. (рис.4). На начальном этапе провели оптимизациютемпературного режима реакции, для этого рассмотрели динамику наращивания ПЦРпродуктов размером 79 п.о, 123 п.о, 179 п.о. при различных температурах отжигапраймеров, в диапазоне от 50°С до 70°С.
(программа 1).9Рисунок 4. Карта праймеров и флуоресцентных зондов TaqMan к фрагменту гена 16S РНК E.coli.В итоге была выбрана оптимальная температура отжига 58 °С, время отжига иэлонгации составило 40 сек (программа 3). Калибровочные растворы ДНКуз готовилипоследовательными десятикратными разведениями, со спектрофотометрическимконтролем в объеме 2 мкл на планшете NanoQuant, TECAN.
В реакцию рвПЦР (SYBRGREEN I) внесли ДНКуз а также праймеры к фрагментам гена 16S РНК E.coli разныхразмеров. Ампликон 911 п.о. на первом этапе показал самую низкую чувствительность(амплификация по программе 2), вследствие его большого размера, и далее в работе нерассматривался. Ампликон 425 п.о. показал наибольшую чувствительность в сравнении состальными ампликонами (амплификация по программе 2). При этом на кривыхплавления для 425 п.о.
и 179 п.о. отсутствовали димеры праймеров (рис. 5В, D). В случаеампликонов 123 п.о., 79 п.о., на кривых плавления есть пики, соответствующие димерампраймеров.Рисунок 5. рвПЦР (SYBR GREEN I). А) График накопления ДНКуз гистона Н1.3, программа 2, праймеры кампликону 425 п.о., 2,5 пг ДНКуз в реакции. В) Кривая плавления продукта амплификации. Т пл 425 п.о. –83,0°С. C) Графики накопления ДНКуз для ампликонов, программа 3, 1) 179 п.о.; 2) 123 п.о.; 3) 79 п.о.,праймеры к ампликонам 179 п.о., 123 п.о, 79 .о. соответственно. D) Кривые плавления продуктовамплификации.
1) Тпл 179 п.о.= 81,1°С, 2) Тпл 123 п.о. = 78,8°С, 3) Тпл 79 п.о. = 77,4°С.Для оценки линейности калибровочных кривых проанализировали результаты 6параллельных определений для каждого из калибровочных растворов. В таблице 110рассчитаны средние значения порогового цикла флуоресценции (С(t)) для каждогоампликона.
Значения внутрисерийного и межсерийного относительного стандартногоотклонения не превышали 5%.Рисунок 6. Калибровочные кривые для результатов амплификации фрагментов 425 п.о., 179 п.о., 123 п.о., 79п.о. рвПЦР (SYBR GREEN I) с указанием уравнений и коэффициентов аппроксимации. Количество ДНКузгистона Н1.3: 2,5 нг; 250 пг; 25 пг; 250 фг; 50 фг; 25 фг; 5 фг; 0 фг.Таблица 1. Результаты рвПЦР (SYBR GREEN I) по программе 2, размер ампликона 425 п.о., по программе3, размер ампликонов 179 п.о., 123 п.о., 79 п.о.РазмерУравнениеампликона,п.о.ЭффективностьконцентрацияРасчетное числореакцииДНК гистона Н1.3УЗИ,цикловLog10(50 фг)42517912379˄Y= -3,3722x+37,339R2=0,9921Е = 10 (-1/-3,3722) =1,98Y= -3,1297x+40,604Е = 10˄ (-1/-3,1297) =2R =0,99032,09Y= -3,1721x+45,494Е = 10˄ (-1/-3,1721) =2R =0,95832,07Y= -3,7955x+49,152R2=0,9679Е = 10˄ (-1/-3,7955) =1,831,69897000431,51,69897000435,31,69897000440,11,69897000442,7Согласно уравнениям калибровочных кривых, значения эффективности реакций вслучае ампликонов 179 п.о., 123 п.о., 79 п.о.
были около 2. На начальном этапе разработкиметода эффективность реакции для ампликона 425 п.о. имела значение 3,39, возможно,это связано с большим размером ампликона и образованием шпилек и другихпространственных структур. Введение в реакцию 3% ДМСО позволило устранитьобразование дополнительных пространственных структур и эффективность реакции дляампликона 425 п.о. стала иметь значение около 2.
При этом расчетное значение С(t) привведении в реакцию предельно допустимой концентрации остаточной ДНК 50 фг11составило 31,5 в случае ампликона размером 425 п.о. и 35,3 для 179 п.о. Для другихампликонов значение этого параметра сдвинуто в область большего значения циклов, гдечувствительность и достоверность результатов ПЦР методики значительно снижается(табл.1). Разработанные праймеры не проявили взаимодействия с ДНКт штаммовэукариотов (СНО К1 DXB11, Pichia pastoris Yeast Strain GS115). Соответственно, вдальнейших исследованиях следует использовать праймеры к ампликону 425 п.о., такжевозможно применение праймеров к 179 п.о.На основе полученных праймеров к геномной ДНК и разработанных ранее праймеров кплазмидной ДНК определили содержание остаточной ДНК в полупродукте очисткиинсулина – рекомбинантном белке-предшественнике (РБ), двух промышленных серияхАФС инсулина и этих же сериях с добавлением в них плазмидной или геномной ДНК(табл.
2). Приведенные в таблице 2 данные указывают на то, что количество геномнойДНК в АФС минимум на порядок превышают содержание плазмидной ДНК.Таблица 2. Количество плазмидной и геномной ДНК в образцах инсулина, рвПЦР (SYBR GREEN I).ДНК, нг/мг сухого вещества (ppm)плазмидная(амплификация по bla-локусу,геномная(амплификация по 16S-локусу,ампликон 252 п.о.)ампликон 179 п.о.)РБ3870±2108650±130Серия 1 (061112)0,4±0,051,52±0,10Серия 2 (091112)0,18±0,041,5±0,5Серия 1 + 1 нг плазмидной ДНК1,36±0,11,0±0,3Серия 2+ 1 нг геномной ДНК0,15±0,012,7±0,6Исследуемый образец инсулинаВ каждом случае было проведено по 9 определений для каждого образца (по 3определения для 3-х независимо приготовленных проб).
Анализ приведенных в таблице 2данных позволяет, прежде всего, заключить, что способ количественного определенияостаточной ДНК с использованием SYBR Green I применим для образцов биомассы,полупродуктов очистки и конечного продукта очистки – субстанции инсулина.Суммарное содержание остаточной плазмидной и геномной ДНК в субстанции инсулинаудовлетворяет фармакопейным требованиям, составляя менее 7 нг на 1 мг белка.
Оценкасодержания ДНК на промежуточных технологических стадиях важна для оптимизациипроизводственного процесса очистки белка.Метод рвПЦР с оптимизированными параметрами был использован для анализаколичества остаточной ДНК в следующих 6 сериях субстанции гистона Н1.3 (151111,220912, 250912, 261012, 381212, 391212). В пробирку вносили ДНК, экстрагированнуюпри помощи набора Cygnus из 10 мкг трипсинолизированной АФС гистона Н1.3, ксубстанции добавляли 50 фг РСО - ДНКуз гистона Н1.3.
В качестве положительногоконтроля также использовали ДНКуз в количестве 50 фг в реакции. Использовали12праймеры к ампликону 425 п.о. Исследования показали, что количество остаточной ДНКштамма-продуцента в субстанциях превышают предельно допустимое значениеконцентрации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
