Автореферат (1091785), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Прииспользовании праймеров к ампликону размером 100 п.о. показатель порогового циклафлуоресценции для АФС инсулина и гистона Н1.3 при использовании SYBR GREEN Iсоставляет 18,8 и 32,0 соответственно. В случае TaqMan при использовании этих жепраймеров и наиболее чувствительного зонда RealTime(5) 5' FAM - ATA CCG CAT AACGTC GCA AGA CCA AAG- BHQ1 - 3' показатель C(t) составил 19,6 в случае инсулина и33,0 в случае гистона Н1.3. Приведенные данные говорят о том, что TaqManдемонстрирует меньшую чувствительность по отношению к SYBR GREEN I, хотя приэтом эффективности обоих типов реакций имели значение 2 (100%).Основными преимуществами метода TaqMan, относительно SYBR GREEN является егоспецифичность, возможность проведения нескольких реакций в одной смеси (напримеродновременное определение содержания плазмидной и геномной ДНК штаммапродуцента в АФС), меньший риск контаминации, большая точность при малыхколичествах субстрата.
Несмотря на преимущества TaqMan, при помощи SYBR GREEN Iможно оценить температуру плавления продукта реакции. Это важно, поскольку разницатемпературы плавления ампликона положительного контроля и ампликона исследуемойсубстанции может говорить о синтезе другого продукта, отличного от ампликона вконтроле. Что было продемонстрировано при анализе остаточной ДНК штаммапродуцента в АФС гистона Н1.3 при использовании праймеров к ампликону размером 425п.о. Кроме того метод с SYBR GREEN I прост в оптимизации для рутинных исследований.Поскольку в случае низкой чувствительности TaqMan зонда, необходимо разработать исинтезировать новый, это дополнительные затраты времени и средств.
Расходы напроведение анализа складываются из стоимости реактивов и готовых наборов дляпроведения методики. Для методики с SYBR GREEN I стоимость анализа одной серииАФС значительно меньше соответствующей для технологии TaqMan.Таким образом, для целей данного исследования был сделан выбор в пользу методикирвПЦР с использованием SYBR GREEN I.3. Сопоставление показателей разработанной методики рвПЦР на основе SYBRGREEN I и параметров коммерческого набора фирмы Cygnus Technologies поопределению остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС генно-инженерногоинсулина человека и генно-инженерного гистона Н1.3 человека.18Была проведена оценка содержания остаточной ДНК E.coli в АФС инсулина и гистонаН1.3 при использовании стандартов и праймеров коммерческого набора на основе SYBRGREEN I (рис.13), DNA Extraction and Amplification Kit for the Measurement of ResidualE.coli Host Cell DNA (#D415T, Cygnus Technologies).Рисунок 13.
рвПЦР (SYBR GREEN I). A) Калибровочная кривая для праймеров Cygnus, количествостандартов из набора в реакции: 100 пг; 10 пг; 1 пг; 0,1 пг; 0,01 пг; 0 пг. Программа амплификации,рекомендованная производителем: 95ºС 10 мин; 45 циклов: 95ºС 15 сек, 55ºС 60 сек.
На калибровкеотмечены точки, соответствующие C(t) для остаточной ДНК АФС инсулина и гистона Н1.3.B)Электрофореграмма в 1,5% агарозном геле продуктов рвПЦР по прошествии 45 циклов: 1 – вода; 2,3 –остаточная ДНК, выделенная из 10 мкг инсулина/ в реакции; 3,4– остаточная ДНК, выделенная из 10 мкггистона Н1.3/ в реакции; 7 – стандарт из набора 100 пг/ в реакции; 8 - стандарт из набора 0,1 пг/ в реакции, 8– маркер молекулярных весов.Эффективность реакции составила 1,95 (рис 13А). Провели электрофорез в 1,5 %агарозном геле. Размер ампликона составил около 150-160 п.о. (рис 13В).
Количествоостаточной ДНК в субстанции инсулина составило 0,05 ppm (показатель С(t)=25), в случаегистона Н1.3. это значение было 0,1 ppb (показатель С(t)=34), что соответствуетвышеуказанным нормам.Рисунок 14. рвПЦР (SYBR GREEN I). A), В) – Кривые плавления для продуктов амплификации праймеровк 16S и праймеров Cygnus соответственно рвПЦР (SYBR GREEN I); С) Калибровочные кривые длярезультатов амплификации разработанных праймеров к 16S и праймеров Cygnus соответственно.Количество ДНКт: 25 нг; 2,5 нг; 250 пг; 25 пг; 250 фг; 50 фг; 25 фг; 5 фг; 0 фг.
D) Электрофореграмма в 2,5%агарозном геле продуктов рвПЦР: 1 – вода; 2,3 - ДНКт гистона Н1.3 2,5 пг/в реакции + праймеры кампликону 425 п.о.; 4,5,6,7 – ДНКт гистона Н1.3 2,5 пг/в реакции + праймеры Cygnus.19Было проведено сравнение результатов рвПЦР (SYBR GREEN I) при использованииразработанных праймеров к 16S РНК E.coli и праймеров из набора Cygnus. Представленыданные на примере ДНКуз гистона Н1.3, размер ампликона для праймеров к 16S РНКE.coli 425 п.о. При этом были полностью соблюдены рекомендации набора Cygnus вотношении количества праймеров и температурного режима реакции.Рассчитали эффективность реакции для обоих пар праймеров, эта величина составила2,06 в случае 16S праймеров и 1,79 в случае праймеров Cygnus. Димеров праймеров дляреакции с 16S праймерами не было выявлено (рис.
14А), в отличие от кривых плавлениядля праймеров из набора Cygnus (рис. 14В), где виден пик в области 60-65 °С,соответствующий димерам праймеров. Это говорит о неоптимальности условий реакции,об этом также свидетельствует разброс температур плавления продуктов ПЦР (рис. 14В).Предел чувствительности метода с праймерами Cygnus и ДНКуз штамма-продуцентагистона Н1.3 в качестве положительного контроля составил 25 пг в реакции.Разработанные праймеры для штамма продуцента гистона Н1.3 более чем в 30 разчувствительнее праймеров коммерческого набора.Электрофорез в 2,5 % агарозном геле в присутствии SYBR GREEN I позволил оценитьразмер ампликонов для продуктов реакции (рис.
14С,D). Для инсулина разработанныепраймеры к геномной ДНК штамма-продуцента также показали наибольшуючувствительность (29 раз), по сравнению с праймерами из коммерческого набора.Количество остаточной ДНК в АФС инсулина составило 1,46 ppm, в случае АФС гистонаН1.3. это значение было 3,1 ppb, что значительно превышает соответствующие значения,установленные набором Cygnus.
Для ампликона размером 100 п.о. получили аналогичныеданные (чувствительность разработанного метода в 29,5 раз больше для ДНКуз гистонаН1.3, для ДНКуз инсулина в 28,8 раз больше чувствительности праймеров набора Cygnus).Таким образом, рассматриваемый коммерческий набор не подходит для определенияминимальных количеств ДНК в субстанции. Его целесообразно применять лишь наначальных этапах разработки методики ПЦР. Разработанный метод во много раз дешевлеприменяемого коммерческого набора. Данная цифра складывалась из стоимостиреактивов и коммерческого набора на проведение анализа одной серии исследуемой АФС.4. Сравнение валидационных характеристик метода ИФА для определенияпроинсулина в генно-инженерной субстанции инсулина на основе набора дляплазмы крови, с соответствующими параметрами другого набора, предназначенногодля оценки содержания проинсулина в субстанции инсулина.Важным параметром контроля качества активной фармацевтической субстанциичеловеческого генно-инженерного инсулина является количественное определениепроинсулин-подобных иммунореактивных белков.Согласно требованиям руководств ЕФ, FDA, ICH и WHO, а также согласно ФСП РN002254/01-081209 для 1 мг АФС инсулина количество определяемых примесей должнобыть не более 10 нг.
Для анализа этого показателя в контрольно-аналитическойлаборатории применяли метод твердофазного иммуноферментного анализа. При этом20использовали коммерческие наборы «ПанкреоИФА-проинсулин» (ЗАО «АлкорБио») и«Proinsulin ELISA» (DRG InstrumentGmbH). Первый набор предназначен длянепосредственного выявления проинсулина в АФС человеческого генно-инженерногоинсулина. Второй набор рекомендован для определения проинсулина в плазме исыворотке крови и применяется в контрольно-аналитической лаборатории ИБХ РАН втечение пяти лет. За указанный промежуток времени провели оценку более 60промышленных серий АФС инсулина.
При этом содержание проинсулин-подобныхиммунореактивных белков в 1 мг инсулина находилось в диапазоне от 0,1 до 1,0 нг.Стоимость анализируемых наборов приблизительно одинакова.Принцип действия наборов основан на методе ELISA (Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay) с использованием двух видов антител – иммобилизованного наповерхности лунок иммуносорбента и коньюгированного с ферментом (пероксидазойхрена) иммунореактанта («сэндвич»-метод).Возможность применения набора «Proinsulin ELISA» для количественногоопределения проинсулина в субстанции человеческого генно-инженерного инсулина былаподтверждена посредством оценки валидационных характеристик на их соответствиекритериям приемлемости.Поскольку ИФА – сложный биохимический метод, регистрируемый сигнал которогоявляется результатом взаимодействия многокомпонентной, каскадной схемы, объемпроведения валидационных исследований, а также критерии приемлемости дляопределяемых параметров определены на основе требований ICH «Guidance for Industry:Bioanalytical Method Validation», а также EMA «Guideline on bioanalytical methodvalidation».Для получения калибровочных кривых проведено 6 параллельных определений длякаждого из стандартных растворов, рассчитаны средние значения оптической плотности(OD), значения внутисерийного (Sотн, % Intra) и межсерийного (Sотн, % Inter)относительного стандартного отклонения.
Количество испытаний при определении Sотн, %Inter составило n=30 для набора «ПанкреоИФА-проинсулин» и n=60 для набора«Proinsulin ELISA». Калибровочные кривые приведены на рисунке 15. Данные для 4параметрической регрессии были получены на основе пакета программ «CurveExpert1.3.0.». Приведенные результаты показывают, что калибровочный график для набора«Proinsulin ELISA» может быть описан как при помощи уравнения 4-параметрическойрегрессии так и линейного уравнения с высокими коэффициентами аппроксимации.Результаты «обратного пересчета» также соответствуют рекомендациям вышеуказанныхруководств и незначительно различаются между собой (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
