Автореферат (1091785), страница 6
Текст из файла (страница 6)
6).При работе с набором «ПанкреоИФА-проинсулин» использование уравнения 4параметрической регрессии позволяет получить существенно более высокиекоэффициенты аппроксимации и выполнить рекомендации руководства. Значенияполученных концентраций должны составлять 85-115% от исходных.21Рисунок 15. А) Калибровочный график для набора «ПанкреоИФА-проинсулин»; В) Калибровочный графикдля набора «Proinsulin ELISA». Данные получены на основе пакета программ «CurveExpert 1.3.0.».Таблица 6.
Характеристики калибровочных кривых для наборов «ПанкреоИФА-проинсулин» и «ProinsulinELISA».Уравнения для калибровочной кривойS отн, %Набор«ПанкреоСстандIntrнг/млan=60ИФА0,5проинсулин» 1,0«ProinsulinELISA»линейноеInter4р регрессиявидR^Y=0,3323х+0,36790,9568ОП,%7,19,75,57,3133,33,54,591,4видY=(0,19*8,582,06,37,1130,35,04,72,1126,510,03,64,202,16,80,02453,65,4117,70,06239,83,989,5ОП,%R^0,99964++4,53*x1,41) //(8,58+x65,9103,71,41)100,499,992,6Y=1,7007х+0,14580,9996100,0Y=(0,16*4,450,99995++9,15*x1,12)//(4,45+x115,192,81,12)0,15573,28,297,7100,40,31139,19,899,6100,50,62269,39,3100,399,9Представленные в таблице 7 результаты определения пределов обнаружения (DL) иколичественного определения (QL) указывают на то, что значения, рассчитанные припомощи линейного уравнения, существенно выше заявленных производителями, а способрасчета, рекомендованный производителями набора «Proinsulin ELISA», приводит крезультатам, близким к заявленным, для обоих наборов.Таблица 7.
Значение предела обнаружения и нижнего предела количественного определения для наборов«Proinsulin ELISA» и «ПанкреоИФА-проинсулин».НаборЗаявленоПанкреоИФАпроинсулинProinsulinELISAНижний предел количественного определения,нг/млПредел обнаружения, нг/мл0,005DLl=3,3*S0/bDL=x+2S0ЗаявленоQLl=10*S0/bQL=3* DL0,1760,1290,300,530,390,0100,0050,030,01522Правильность может быть выражена как разность между средним и истиннымзначением с учетом доверительных интервалов или в процентах найденного значения отвведенного количества.Определения проводили для двух параллельных проб в двух повторностях.
Результатысоответствовали критериям приемлемости: средние значения концентрации, близких кверхнему и нижнему пределу количественного определения, находились в диапазоне±25% от номинальных, на остальных уровнях концентрации - в диапазоне ±20% отноминального значения. Значения внутрисерийного и межсерийного относительногостандартного отклонения не превышали 20% при концентрациях проинсулина, близких книжнему пределу количественного определения, и 15% в остальных случаях.Специфичность метода считается приемлемой, если величина отклика сигналаматрицы, не содержащей аналита, не превышает 20% от нижнего пределаколичественного определения, либо если при добавлении аналита (внутреннего стандарта)полученный отклик отличается от сигнала стандартного раствора не более чем на 5 %.При определении количества проинсулина в субстанции инсулина эти «прямые» методыоценки специфичности непригодны, так как невозможно получить свободную от аналитаматрицу (субстанция инсулина всегда содержит проинсулин).В подобных случаях вывод о приемлемости специфичности метода делается порезультатам оценки правильности, полученными с использованием «внутреннегостандарта».
Критерием приемлемости считается различие между количествомпроинсулина, введенного в образец и полученного в результате измерений, не более 20%во всем диапазоне и не более 25% в области верхнего и нижнего предела обнаружений.С целью определения интервала концентраций инсулина, в котором будут выполнятьсятребования к правильности, были приготовлены серии растворов, содержащих одинаковоеколичество проинсулина из контрольной пробы и такие количества испытуемойсубстанции, чтобы общее содержание проинсулина по возможности соответствоваловсему диапазону калибровочного графика.
При испытаниях субстанции с высокимсодержанием проинсулина с помощью набора «ПанкреоИФА-проинсулин» требования кправильности выполняются во всем диапазоне концентраций при соответствующихзагрузках инсулина, рекомендованных производителем (от 0,5 нг до 3,3 нг в лунке). Прииспытаниях субстанции с низким содержанием проинсулина требования к правильностиформально выполняются при загрузках инсулина, в 4 раза превышающихрекомендованные производителем, но при этом количество содержащегося в субстанциипроинсулина близко к нижнему пределу количественного определения.
При дальнейшемувеличении загрузки оптическая плотность анализируемого раствора продолжаетснижаться (рис. 16). При испытаниях субстанции с высоким содержанием проинсулинапри помощи набора «Proinsulin ELISA» требования к правильности выполняются при всехзагрузках инсулина, соответствующих диапазону определения, а при определеннойзагрузке инсулина - во всем диапазоне концентраций проинсулина.23Рисунок 16. Графическое отображение зависимости определяемой концентрации проинсулина отколичества внесенного инсулина А) для набора «ПанкреоИФА-проинсулин»; В) для набора «ProinsulinELISA» (субстанция содержит 0,2 нг проинсулина в 1 мг инсулина).Таким образом, результаты оценки правильности с использованием внутреннегостандарта позволяют считать специфичность метода определения содержанияпроинсулина в субстанции инсулина при помощи набора «Proinsulin ELISA»удовлетворительной при загрузках инсулина не более 0,16 мг в лунке.Линейность при разведении. При разбавлении субстанции 06-160409 с содержаниемпроинсулина 8,7 нг/мг, при использовании набора «ПанкреоИФА-проинсулин»,полученные результаты соответствовали требованиям производителя, внутрисерийное имежсерийное относительное стандартное отклонение не превышало 10 % (при заявленных8%).
Данные, полученные при разбавлении субстанций 01-150109 и 06-160409 припомощи набора «Proinsulin ELISA» показали, что различие ожидаемых и полученныхрезультатов находилось в интервале 90-110%, внутрисерийное и межсерийноеотносительное стандартное отклонение не превышало 10%.На основании полученных результатов было предложено при анализе субстанцийинсулина готовить серии двукратных разведений в интервале концентраций 1,5-0,01мг/мл(с учетом рекомендуемого производителем объема аликвоты 100 мкл).Использование набора «ПанкреоИФА-проинсулин» невозможно при содержанииинсулина, более чем в 3 раза превышающее рекомендованное производителем, что непозволяет анализировать субстанции инсулина с содержанием проинсулина менее 1 нг/мг.V. Выводы1) Разработан метод рвПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli,на примере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулина человеческого игенно-инженерного гистона Н1.3 человеческого.2) Показана одинаковая чувствительность метода рвПЦР при использовании SYBRGREEN I и технологии TaqMan.
Сделан выбор в пользу методики рвПЦР сиспользованием SYBR GREEN I, по причине ее простоты для рутинных исследований.Метод рвПЦР при использовании SYBR GREEN I дешевле методики рвПЦР сприменением технологии TaqMan.3) Установлено, что методика рвПЦР с использованием SYBR GREEN I имеетчувствительность в 30 раз больше коммерческого набора по определению остаточной24ДНК E.coli в АФС фирмы Cygnus Technologies. При этом использование разработанногометода значительно снижает стоимость анализа. Тем самым, подтвержденанеобходимость разработки праймеров, используемых в методе рвПЦР, для конкретныхпромышленных рекомбинантных штаммов в рамках определенного фармацевтическогопроизводства.4) Проведено сравнение валидационных характеристик наборов «Proinsulin ELISA» и«ПанкреоИФА-проинсулин» для количественного определения проинсулина методомтвердофазного ИФА.
Показана возможность получения достоверных результатов приопределении содержания проинсулина в АФС инсулина методом твердофазного ИФА сиспользованием набора «Proinsulin ELISA», рекомендованного для определенияпроинсулина в плазме крови. Эта возможность востребована при анализе субстанций снизким содержанием проинсулина (менее 1 нг/мг).5) Результаты исследований положены в основу нормативной производственнойдокументация для методик контроля остаточных производных штаммов-продуцентов всубстанциях рекомбинантного инсулина и гистона H1.3 на Опытном биотехнологическомпроизводстве ИБХ РАН.VI.
Список опубликованных научных работ по теме диссертации:1) Ковалёва Е.В., Баранник А.П., Шибанова Е.Д., Скоблов Ю.С., Швец В.И. Разработка иприменение метода рвПЦР для анализа остаточной ДНК штамма-продуцента всубстанции гистона Н1.3.// Биотехнология. – 2015. - №2. – С. 65-752) Ковалёва Е.В., Кириллова Л.Н., Шибанова Е.Д., Баирамашвили Д.И. Сравнениевалидационных характеристик метода ИФА при использовании коммерческих наборовдля определения проинсулин-подобных иммунореактивных белков в субстанцииинсулина человеческого генноинженерного.// Биофармацевтический журнал. – 2014. – Т.6.– С. 52-613) Скоблов М.Ю., Шибанова Е.
Д., Ковалева Е.В., Баирамашвили Д.И., Скоблов Ю.С.,Мирошников А.И. Количественное определение содержания ДНК в генно-инженерныхактивных фармацевтических субстанциях методом ПЦР в реальном времени.//Биоорганическая химия. – 2010. - Т.36. – №1. – С. 119-1234) Ковалева Е.В., Баранник А.П., Шибанова Е.Д., Швец В.И. Оптимизация метода ПЦР вреальном времени для определения остаточной ДНК штамма-продуцента вбиофармацевтиески субстанциях. TaqMan или SYBR GREEN I?// XIII Международнаянаучно-практическая конференция Inter-Medical «Теоретические и практические аспектыразвития научной мысли». – Москва.
- 2015г. – С.51-575) Синявина Н.М., Ковалева Е.В., Шибанова Е.Д., Баирамашвили Д.И. Сравнениевалидационных характеристик метода ИФА при использовании коммерческих наборовдля определения проинсулин-подобных иммунореактивных белков в субстанцииинсулина человеческого генно-инженерного.// Пленарный доклад на Международномсимпозиуме «Биофарма-2010 от науки к промышленности». – Ереван.
– 2010.256) Шибанова Е.Д., Скоблов Ю.С., Ковалева Е.В., Баирамашвили Д.И. Особенностиконтроля качества лекарственных средств, получаемых методами генной инженерии.Применение ПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцента.// Пленарный доклад на Международном симпозиуме «Биофарма-2009 от науки кпромышленности». – Анталия. – 2009.Ковалева Екатерина ВикторовнаРазработка и применение методов ПЦР и ИФА для анализа остаточных ДНК и белковштаммов-продуцентов в биофармацевтических субстанцияхПодписано в печатьЗаказ №Формат 60х90/16. Усл.
печ. л. 1Тираж 100 экз.ООО «Генезис»119571, г. Москва, пр-т Вернадского,86(495) 936-88-35(495) 434-83-5526.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
