Диссертация (1091787), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Все эти подходы оценивают количествопродукта реакции в определенный момент течения процесса (обычно после егозавершения), давая исследователю лишь статичную картину динамического процесса.При регистрации накопления продуктов амплификации на протяжении всегопроцесса, исследователь получает всю информацию об особенностях реакции. Знаякинетику процесса, можно уже оценивать начальные параметры реакции и сравниватьреакции между собой.2.8.3.2. ПЦР в режиме реального времени в качестве диагностическогоинструмента.Переход метода из научно-исследовательской в диагностическую лабораториюсопряжен с рядом возникающих проблем: уровень специальной подготовки сотрудниковдиагностической лаборатории принципиально отличается от подготовки сотрудниковнаучно-исследовательского института.
В медицинской диагностике гораздо вышетребования к воспроизводимости получаемых результатов, выходные данные методадолжны быть стандартизованы, аттестованы и т.п.В этой связи можно сформулировать основные направления развития ПЦР вближайшем будущем.1. Повышение общей надежности метода;2. Дальнейшее упрощение процедуры анализа;3. Сокращение времени исследования;4. Широкое внедрение количественной ПЦР.Эти тенденции будут реализованы за счет использования флуоресцентных методовдетекции продуктов амплификации, автоматизации и применения компьютерных методоврегистрации и трактовки результатов исследования.Уже сейчас техника выполнения процедур при проведении ПЦР-диагностикидовольно проста. В клинической лаборатории диагностическое исследование принятоподразделять на три этапа:- пробоподготовка (очистка ДНК или РНК исследуемого объекта от примесей);- амплификация определенного фрагмента ДНК;- регистрация результатов амплификации.Развитие методик пробоподготовки можно прогнозировать в направлении повышенияэффективности лизиса и удаления ингибиторов и автоматизации процесса.
Некоторыеобразцы биоматериала содержат агенты, существенно снижающие эффективностьреакции. При проведении количественного ПЦР-анализа отличие в эффективности51амплификации может нести существенную ошибку, поэтому с распространениемколичественного анализа, требования к чистоте получаемой ДНК повышаются. Для этапаамплификации стоит отметить тенденцию к переходу от использования отдельныхреакционных пробирок к стандартным форматам скрепленных пробирок (8- или 12луночные стрипы или 96- или 384 – луночные планшеты).
При этом возможностьиспользования многокональных пипеток и дозаторов ускоряет процедуру приготовленияреакционной смеси. Крупные диагностические центры, при использовании планшетныхформатов, могут применять роботизированные дозирующие станции, снижающиевероятность ошибки лаборанта.Достоверность исследования в значительной мере связана со способом детекции иинтерпретации результатов ПЦР.В настоящее время можно выделить четыре системы детекции результатов ПЦР,наиболее часто применяемые в диагностических лабораториях:- Гель-электрофорез;- Гибридизационно-ферментный анализ (ГиФА);- Флоуресцентная детекция результатов после ПЦР (FLASH);- Флоуресцентная детекция в течение реакции (ПЦР в «реальном времени»).Последние две методики отличаются тем, что продукт амплификации дляопределения не извлекается из пробирки, а регистрация результатов протекает в закрытойпробирке.
Тем самым решается одна из ключевых проблем внедрения метода ПЦР вмедицинскую и аналитическую лабораторную практику – проблема контаминации [71].2.8.3.3. Типы ПЦР в режиме реального времени.Типы real-time PCR различаются по способам генерации репортерной флуоресценции.Два основных принципа - это:1. Применение интеркалирующих флуоресцентных агентов, флуоресценция которыхзначительно возрастает при связывании с двуцепочечной ДНК,2. Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб,комплементарных участку PCR-продукта.2.8.3.3.1. Неспецифичные системы детекции2.8.3.3.1.1.
Интеркалирующие красители.Использование интеркалирующих красителей представляет собой наиболее дешевыйи простой вариант окраски ДНК для цепей ПРЦ в режиме реального времени. SYBR GreenI является одним из наиболее чувствительных красителей, применяемых для детекциидвуцепочечных молекул ДНК при электрофорезах в агарозных и полиакриламидных гелях52[72].
Чувствительность этого красителя приблизительно в 25 раз выше, по сравнению снаиболее распространенным до настоящего времени бромистым этидием (EtBr).Рисунок 15. Принцип работы красителя SYBR Green I.2.8.3.3.1.1. Меченые праймеры с адаптерной последовательностью (« амплифлюры »).Существуетнескольковариантовиспользованияадаптерных5'-концевыхпоследовательностей для регистрации накопления продукта с участием флуоресцентномеченого праймера.
В наиболее простом варианте исполнения праймер несет дополнительную последовательность на 5'-конце, способную образовывать шпилечнуюструктуру (типа «стебель-петля», причем «стебель» обычно делают в 5-6 пар нуклеотидов,большинство из которых G-C) (в литературе такие системы получили название праймеров«амплифлюр») (рисунок 16, а). Последовательность петлевой части может захватыватьчасть последовательности мишени (что сокращает длину олигонуклеотида) или же бытьполностью «независимым» адаптером (что позволяет использовать один проверенный ихорошо работающий стандартный адаптер для разных праймеров). Праймеры несутфлуоресцентную метку (флуорофор) и гаситель флуоресценции, расположенные так, чтопри образовании шпилечной структуры флуорофор и гаситель оказываются сближены.
Врастворепраймерысохраняютструктурушпильки,имеющуюнизкийуровеньфлуоресценции. В ходе реакции шпилька меченого праймера раскрывается (посколькумеченый праймер становится частью двуцепочечного продукта), что приводит к усилениюсигнала (рисунок 16, а). Описан вариант метода, в котором гаситель находится наотдельномолигонуклеотиде,комплементарном5'-концевойадаптернойпоследовательности. В этом случае при встраивании праймера в ДНК гибридизация сгасящим олигонуклеотидом оказывается невозможной (рисунок 16, b).53Рисунок 16. Схема работы праймеров «амплифлюр».а) Праймер содержит 5’ – адаптер с инвертированным повтором, по краям которого расположеныфлуорофор и гаситель флуоресценции.
При температуре элонгации инвертированный поврот образуетшпилечную структуру, в которой флуорофор и гаситель сближены. В ходе синтеза дочерней цепи ДНКшпилечная структура «разворачивается» и интенсивность флуоресценции возрастает.b) Праймер содержит меченый 5’ – адаптер, комплементарный дополнительному олигонуклеотиду сгасителем. Синтез второй цепи «сталкивает» олигонуклеотид с гасителем.Другой вариант методики предполагает использование стандартных меченыхгибридизационныхпроб,комплементарныхспециальной5'-концевойадаптернойпоследовательности [72].
Флуоресцентно меченые олигонуклеотиды работают попринципу разрушаемых проб или проб с инвертированным концевым повтором (см.ниже), однако детекция продуктов реакции идет неспецифично, поскольку адаптернаяпоследовательность находится на праймере (подход удобен лишь тем, что один комплектпроб можно использовать во множестве экспериментов, добавляя стандартный немеченыйадаптер к праймеру).2.8.3.3.2.
Специфичные системы детекции.Специфичные системы позволяют достоверно регистрировать накопление фрагментаДНК строго определенной последовательности. Поскольку даже хорошо подобраннаяпара праймеров может давать нежелательные продукты амплификации (наиболее частымииз которых являются димеры праймеров), использование методик с регистрациейнакоплениялишь«нужных»фрагментовДНКявляетсяболеенадежнымэкспериментальным подходом.Все специфичные системы детекции продуктов ПЦР отличаются наличием вреакционной смеси меченого олигонуклеотида (или нескольких олигонуклеотидов),неспособного выступать в качестве затравки и комплементарного уникальной частиамплифицируемойпоследовательности.Меченыйолигонуклеотидможетбытьприкреплен к праймеру или находиться в растворе в свободной форме (в этом случае егозащищают от удлинения полимеразой блокатором полимеризации).542.8.3.3.2.1.
Праймеры-пробы («скорпионы»)В данном варианте специфичной «проявки» результатов ПЦР разработчики методапостарались решить проблему детекции неспецифичных продуктов реакции, объединивпраймер и гибридизационную пробу в одну молекулу. Для этого к 5'-концу праймераприкрепили адаптер со структурой типа «стебель-петля», в котором петлевая частьадаптерной шпильки комплементарна внутренней части образующегося фрагмента(рисунок 17).Рисунок 17. Схема работы праймеров «скорпионов». Флуоресцентно-меченная 5'-концевая адаптерная часть(проба) отделена от 3'-концевой части (праймер) блокатором, препятствующим синтезу второй цепи ДНК(обозначено ломаной линией).
При температуре элонгации проба еще не сработавшего (свободного)праймера формирует шпилечную структуру со сближенными флуорофором и гасителем. Поскольку петлевая часть пробы комплементарна внутренней части амплифицируемого фрагмента, после встраивания вДНК она гибридизуется с фрагментом, приводя к разобщению флуорофора и гасителя.Эта структура практически полностью повторяет описанные выше праймеры типа«амплифлюр» с той лишь разницей, что адаптер отделен от праймера блокатором синтезавторой цепи ДНК (во избежание его удвоения). Таким образом, после образованияпродукта реакции, петлевая часть адаптерной последовательности может гибридизоватьсяна внутреннюю часть фрагмента, что ведет к разобщению флуорофора и гасителяфлуоресценции, и, как следствие, к возрастанию уровня флуоресценции [73, 74, 75](образующаяся при этом структура напомнила разработчикам хвост скорпиона, давназвание подходу).
Предложен также вариант аналогичных праймеров с гасителемфлуоресценции, расположенном на отдельном олиго-нуклеотиде [76].Несмотря на то, что большинство авторов при описании работы праймеров-проб неупоминают влияние 5'-экзонуклеаз-ной активности Taq-полимеразы (в том числе и авторысамих «скорпионов»), очевидно, что при синтезе второй цепи ДНК гибридизованная частьпраймера-пробы может разрушаться ферментом (в точности, как это происходит прииспользовании разрушаемых проб, см.
ниже). Следовательно, в общей интенсивностифлуоресцентного сигнала будет как составляющая «разворачивания», так и составляющаяразрушения адаптера [77].552.8.3.3.2.2. Свободные меченые пробы«Вытесняющие пробы» (displacing probes). В данном подходе используют пробу,представляющую собой пару частично комплементарных друг другу олигонуклеотидов,один из которых несет флуорофор, а другой — гаситель флуоресценции. В отсутствиемишени проба образует дуплекс, в котором флуоресценция подавлена.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
