Диссертация (1091787), страница 16
Текст из файла (страница 16)
В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазеобразуется специфический комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают отнесвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела. Послевторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяютферментативнуюконцентрацииактивностьисследуемогоиммунокомплексаантигенносителя,антигена.котораяНаоказываетсяпропорциональнастадиикакбывыявлениязажатымначальнойспецифическогомеждумолекуламииммобилизованных и меченых антител, что послужило поводом для широкогораспространения в литературе названия «сэндвич» - метод (англ. sandwich). Как следует изописания метода, он может быть использован для анализа только тех антигенов, наповерхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты, а дляанализа большого числа моновалентных антигенов (например, стероидные гормоны,пестициды) он неприемлем.
Данная схема проведения анализа требует затраты большоговремени, так как состоит из нескольких последовательных операций, однако обладаетрядом существенных достоинств, обусловливающих ее широкое применение. Основнымиз них является высокая чувствительность метода, превышающая возможности другихсхем ИФА. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадиианализа зависит от равновесной константы связывания реакции антиген — антитело иконцентрации компонентов. При данной константе связывания, характеризующейиспользуемые в конкретном эксперименте антитела, и при крайне низких концентрацияхантигена рассматриваемый метод дает возможность сдвигать равновесие в сторонуобразования специфических комплексов за счет использования избытка (по сравнению сконцентрацией антигена) иммобилизованных и меченных ферментом антител.Максимальнаячувствительностьдостигаетсяприпроведениикаждойиммунологической реакции в равновесном режиме, что и определяет длительностьанализа, которая в среднем составляет 4-6 часов.
Если не учитывать возможностьнеспецифическихвзаимодействийнастадиивыявленияспецифическихиммунокомплексов с помощью ферментного конъюгата, то предел обнаруженияантигенов данным методом зависит от чувствительности регистрации ферментной меткина носителе. При использовании высокочувствительных систем детекции ферментативнойактивности предел обнаружния соединений данным методом в настоящее время достигаетвеличины порядка 10-21 моль, что соответствует обнаружению в образце всего 600молекул анализируемого соединения.71Так как перед стадией регистрации ферментативной активности проводят отмывкуносителя от компонентов исследуемых жидкостей, то метод исключает влияние наферментативную активность и, следовательно, на результаты анализа присутствующих ванализируемой пробе эффекторов.«Сэндвич» - метод методически упрощается, если анализируемый антиген и меченыеантитела добавлять к иммуносорбенту одновременно (рис.
30).Рисунок 30. Схема метода ИФА с использованием меченых антител и иммобилизованных антител.Одностадийный «сэндвич» - анализ.I – инкубация; II – отмывка; III - определение ферментативной активности- проинсулин;- специфическое антитело.- пероксидаза хрена;Иногда в литературе эта схема называется одностадийным с сэндвич - анализом.
Как ив предыдущем случае, на носителе образуется тройной комплекс с участием меченыхантител,концентрациякоторогопропорциональнаначальнойконцентрацииопределяемого антигена.Однако чувствительность одностадийной схемы ниже, чем двухстадийной, а контактфермента с анализируемой средой может неблагоприятно отражаться на результатаханализа.Метод с использованием меченых антивидовых антител и иммобилизованныхспецифических антител.
Метод является усложненным вариантом «сэндвич» - анализа, вкотором образование комплекса детектируется не непосредственно введением в негомеченного ферментом антитела, а с помощью содержащих ферментативную меткуантивидовых антител [93].72Рисунок 31. Схема метода ИФА с использованием меченых антивидовых антител и иммобилизованныхспецифических антител. Усложненный вариант «сэндвич» - анализа.- проинсулин;- специфическое антитело 1- пероксидаза хрена;- антивидовое антитело;- специфическое антитело 2Необходимым условием получения адекватных результатов является отсутствиеперекрестного взаимодействия антител к проинсулину с инсулином человека, посколькупри помощи данного метода определяют остаточное содержание проинсулина вприсутствии генно-инженерного инсулина человека.
Перекрестное взаимодействиеобусловлено тем, что антитела способны связываться с любым антигеном, содержащимсоответствующий эпитоп [93]. Таким образом, если предположить, что инсулинконкурентно взаимодействует с иммобилизованными антителами (рисунок 32, 2А), либоантителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (рисунок 32, 2В), чувствительностьметода может заметно снижаться, особенно при увеличении концентрации инсулина врастворе.
Поскольку количество комплексов с проинсулином уменьшается, интенсивностьокраски убывает.73А)В)Рисунок 32. Схема метода ИФА при перекрестном взаимодействии антител к проинсулину с инсулином.А) Перекрестное взаимодействие с инсулином иммобилизованных антител;В) Перекрестное взаимодействие с инсулином конъюгированных с пероксидазой хрена антител;IV- отмывка №2- проинсулин;- инсулин;- пероксидаза хрена;- антитело, способное к перекрестному взаимодействию;- антитело, высокоспецифичное к проинсулину.2.9.5. Интерпретация результатов ИФА.Зависимость величины ферментативной активности специфического комплекса сферментной меткой от количества любого компонента комплекса изображается в видедоза-ответной кривой, где на оси ординат отложена интенсивность сигнала субстратапосле его ферментативного превращения, измеренная в момент времени t, а по осиабсцисс концентрация определяемого реагента в пробе.Методы выражения концентрации антигена.
В тех случаях, когда антиген можнополучить в очищенном виде, готовят стандартные растворы с известной концентрациейантигена и строят калибровочную кривую. По ней, зная величину сигнала для неизвестнойпробы, можно рассчитать концентрацию определяемого антигена, которая выражаетсяобычно в нг/мл или моль. Точность результатов максимальна в линейной области дозаответной кривой, так как чем больше наклон кривой, тем выше точность анализа.Методывыраженияконцентрацииантител.Количественноеизмерениеконцентрации антител в твердофазном ИФА невозможно. Это связано с тем, чтоколичество антител в специфическом комплексе зависит не только от концентрацииантител в исследуемой пробе, но и от их аффинности, при этом имеет место конкуренциямеждунизко-ивысокоаффиннымиантителамизаантигенныедетерминантыиммуносорбента. Поэтому положение и наклон доза-ответной кривой будет отличаться74как для сывороток, содержащих разное соотношение иммуноглобулинов различныхклассов, так и для сывороток с одинаковым соотношением иммуноглобулинов, но сразличной аффинностью.
Кроме того, концентрация антител в исходных сывороткахможет меняться в широком интервале. Это приводит к тому, что вместо абсолютнойконцентрации антител проводят оценку их антительной активности.Краткий обзор методов построения калибровочной кривой (КК). Процесспостроения КК представляет собой задачу аппроксимации зависимости оптическойплотности от концентрации аналита в пробе. Нахождение приближенных значенийфункции в промежутках между точками с известными ее значениями называютинтерполяцией. С интерполяцией мы сталкиваемся тогда, когда строим КК такимобразом, чтобы все калибровочные точки лежали на ней.
Частным случаем интерполяцииявляется экстраполяция. С экстраполяцией мы имеем дело в случае, когда нужноопределить концентрацию аналита в пробе, оптическая плотность (ОП) продуктаферментативной реакции в которой выше, чем в калибровочной пробе (КП) смаксимальной ОП или ниже, чем в КП с минимальной ОП.Методы описания зависимости между набором концентраций КП и соответствующихим значений оптических плотностей можно разделить на эмпирические, в которых неделается никаких предварительных предположений о природе искомой зависимости, т.е. овиде калибровочной кривой, и методы, основанные на теоретических предположениях отом, к какому семейству должна принадлежать функция, описывающая КК.
Дляпостроения КК используют два основных подхода — «ручной», с использованиемграфических построений, либо методы с применением компьютерных вычислений.Форму кривой можно модифицировать, меняя масштаб концентраций антигена,откладываемых по оси абсцисс. Масштаб может быть линейным (рисунок 33 А) илилогарифмическим (рисунок 33 В). Линейный масштаб используется обычно приопределении концентрации измеряемого вещества в узком диапазоне.
В широкомдиапазоне, при изменении концентрации антигена в калибровочных пробах более чем наодин порядок, лучше использовать логарифмическую шкалу. В случае сэндвич-анализалогарифмического преобразования может быть достаточно для линеаризации КК.75Рисунок 33. График зависимости интенсивности сигнала от концентрации аналита в наборе калибровочныхпроб для типичного сэндвич-ИФА (А) и типичного конкурентного ИФА (В).По оси ординат также могут откладываться разные величины: непосредственнорегистрируемый сигнал (оптическая плотность раствора после остановки ферментативнойреакции), его логарифм, отношение концентрации свободного аналита к концентрациисвязанного в арифметической или логарифмической формах или результаты специальныхсложныхпреобразований.Примеромтакогоспециальноголинеаризующегопреобразования служит предложенное Родбардом преобразование logit.Все теоретические методы построения КК основаны на том, что природа зависимостисигнала от концентрации аналита считается известной и может быть выражена вматематической форме.
За счет этого можно частично скорректировать ошибки висходных данных конкретного анализа, поскольку математическое представление кривойрезко ограничивает число возможных конфигураций, которые эта кривая можетпринимать. Недостатком метода является то, что математические модели основаны наупрощенных молекулярно-кинетических схемах иммуноанализа. Тем не менее, вбольшинстве случаев эти методы представляют собой наилучший алгоритм построениякалибровочных графиков.Наиболее корректными считаются в настоящее время такие теоретические методыпостроениякалибровочногографика,кактеоретическая4-параметрическаялогарифмическая логистическая модель (4PL) и преобразование logit-log, являющеесячастным случаем 4PL [105]. Четыре параметра, оценивающиеся в модели 4PL припостроении КК в конкурентном анализе, — это средний уровень сигнала для бесконечнойдозы (фоновый сигнал); средний уровень сигнала для «0» концентрации аналита; отрезок,отсекаемый прямой на оси Y и угловой коэффициент прямой.
Развитием модели 4PL76стала 5-параметрическая логистическая модель (5PL), где добавляется еще пятыйпараметр, характеризующий степень асимметрии кривой [106].Соответственно, методы математической обработки данных могут вносить ничуть неменьший вклад в получение ложных результатов, если будут подобраны неверно, ииграют в иммуноанализе не менее важную роль, чем способ подготовки образцов илиточность пипетирования.III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
