Диссертация (1091787), страница 20
Текст из файла (страница 20)
были около 2 (рис. 41). На начальном этаперазработки метода эффективность реакции для ампликона 425 п.о. имела значение 3,39,возможно, это связано с большим размером ампликона и образованием шпилек и другихпространственных структур. Введение в реакцию 3% ДМСО позволило устранитьобразование дополнительных пространственных структур и эффективность реакции дляампликона 425 п.о. стала иметь значение около 2. При этом расчетное значениепорогового цикла флуоресценции - С(t) при введении в реакцию предельно допустимойконцентрации остаточной ДНК 50 фг составило 31,5 в случае ампликона размером 425п.о. и 35,3 для 179 п.о. Для других ампликонов значение этого параметра сдвинуто вобласть большего значения циклов, где чувствительность и достоверность результатовПЦР методики значительно снижается (табл.7).
Разработанные праймеры не проявиливзаимодействия с ДНКт штаммов эукариотов (СНО К1 DXB11, Pichia pastoris Yeast StrainGS115). Соответственно, в дальнейших исследованиях следует использовать праймеры кампликону 425 п.о., также возможно применение праймеров к 179 п.о.На основе полученных праймеров к геномной ДНК и разработанных ранее праймеров кплазмидной ДНК определили содержание остаточной ДНК в полупродукте очисткиинсулина – рекомбинантном белке-предшественнике (РБ), двух промышленных серияхАФС инсулина и этих же сериях с добавлением в них плазмидной или геномной ДНК(табл.
8). Приведенные в таблице 8 данные демонстрируют тот факт, что количествогеномной ДНК в АФС минимум на порядок превышает содержание плазмидной ДНК.Таким образом, определение содержания геномной ДНК является корректным подходомдля анализа количества остаточной ДНК штамма-продуцента в АФС.91Таблица 8. Количество плазмидной и геномной ДНК в образцах инсулина, рвПЦР (SYBR GREEN I)Исследуемый образец инсулинаДНК, нг/мг сухого вещества (ppm)плазмиднаягеномная(амплификация по bla-локусу,(амплификация по 16S-локусу,ампликон 252 п.о.)ампликон 179 п.о.)РБСерия 1 (061112)Серия 2 (091112)Серия 1 + 1 нг плазмидной ДНКСерия 2+ 1 нг геномной ДНК3870±2100,4±0,050,18±0,041,36±0,10,15±0,018650±1301,52±0,101,5±0,51,0±0,32,7±0,6В каждом случае было проведено по 9 определений для каждого образца (по 3определения для 3-х независимо приготовленных проб).
Анализ приведенных в таблице 8данных позволяет, прежде всего, заключить, что способ количественного определенияостаточной ДНК с использованием SYBR Green I применим для образцов биомассы,полупродуктов очистки и конечного продукта очистки – субстанции инсулина.Суммарное содержание остаточной плазмидной и геномной ДНК в субстанции инсулинаудовлетворяет фармакопейным требованиям, составляя менее 7 нг на 1 мг белка. Оценкасодержания ДНК на промежуточных технологических стадиях важна для оптимизациипроизводственного процесса очистки белка.Метод рвПЦР с оптимизированными параметрами был использован для анализаколичества остаточной ДНК в следующих 6 сериях субстанции гистона Н1.3 (151111,220912, 250912, 261012, 381212, 391212).
В пробирку вносили ДНК, экстрагированнуюпри помощи набора Cygnus из 10 мкг трипсинолизированной АФС гистона Н1.3, ксубстанции добавляли 50 фг РСО - ДНКуз гистона Н1.3. В качестве положительногоконтроля также использовали ДНКуз в количестве 50 фг в реакции. Использовалипраймеры к ампликону 425 п.о. Исследования показали, что количество остаточной ДНКштамма-продуцентавсубстанцияхпревышаютпредельнодопустимоезначениеконцентрации. Для исследованных серий эти значения были в диапазоне от 160 до 800 фг(от 16 до 80 ppb). Сводные данные для серии 381212 АФС гистона Н1.3 представлены нарисунке 42 и в таблице 9.92Рисунок 42.
рвПЦР (SYBR GREEN I) А) Метод добавок. Графики накопления ДНКуз для ампликона 425п.о., программа 2;1 - ДНК, выделенная из трипсинолизированной АФС гистона Н1.3 (количество белка 10мкг в реакции) + ДНКуз 50 фг в реакции; 2 - ДНК, выделенная из трипсинолизированной АФС гистона Н1.3(количество белка 10 мкг в реакции);3 – ДНКуз 50 фг в реакции. В) Кривые плавления продуктовамплификации.Таблица 9. Метод добавок.
Результаты рвПЦР (SYBR GREEN I) по программе 2, размер ампликона 425 п.о.НаименованиеЧисло цикловДНКуз гистона Н1.3 50 фгДНК, выделенная из 10 мкгтрипсинолизированной субстанциигистона Н1.3ДНК, выделенная из 10 мкгтрипсинолизированной субстанциигистона Н1.3 + ДНКуз гистонаН1.3 50 фг31,5Расчетная концентрация остаточной ДНК,фг по уравнению калибровкиY= -3,3722x+37,339;R2=0,992153,727,6770,127,5824,5Температура плавления продуктов рвПЦР для ДНКуз 83,1°С соответствовалаампликону размером 425 п.о., этот показатель в случае АФС и АФС+ДНКуз составлялоколо 79,0 °С. Электрофоретический анализ в агарозном геле в присутствии SYBRGREEN I (рис.
43) показал, что случае РСО полоса на электрофореграмме соответствовалаампликону размером 425 п.о. В образцах АФС гистона Н1.3 имела место амплификациядругого продукта. В случае АФС инсулина кривая плавления продуктов реакции такжеимела пик в области 79,0 °С.Рисунок 43. Электрофореграмма в 5% агарозном геле продуктов амплификации фрагмента 425 п.о. вприсутствии SYBR GREEN I. Программа 2. Метод добавок, концентрации в реакции: 1 – вода; 2 - ДНК,выделенная набором Cygnus из 10 мкг трипсинолизированной АФС гистона Н1.3; 3 - ДНК, выделеннаянабором Cygnus из 10 мкг трипсинолизированной АФС гистона Н1.3 + ДНК гистона Н1.3 50 фг; 4- ДНКгистона Н1.3 50 фг; 5 – Маркер молекулярных весов.93Для устранения возможности образования шпилек и других пространственныхструктур ДНК в реакцию ввели 3% ДМСО, что повысило эффективность реакции, этоможно судить по S-образности кривой накопления амплификата (рис.
44А). Данныеизмерений при концентрации ДМСО от 1% до 5% позволяют заключить, что оптимальнойдля данной реакции является концентрация ДМСО 3%. При 5% концентрации ДМСО вреакцииэффективностьпрепятствуетотжигуеезначительнопраймерови,снижается,соответственно,посколькуколичествоизбытокПЦРДМСОпродуктауменьшается. Вследствие добавления 3% ДМСО в реакцию температура плавления всехпродуктов понизилась на 4 °С. Для ДНКуз для ампликона 425 п.о.
составляла 79,0°С, этотпоказатель в случае АФС и АФС+ДНКуз имел значение около 75,5 °С (рис. 44В).Электрофоретическая картина была аналогична рисунку 43.Рисунок 44. А) Метод добавок. Графики накопления ДНКуз гистона Н1.3 для ампликона 425 п.о.,программа 2; 1,2 - ДНК, выделенная из трипсинолизированной АФС гистона (количество белка 10 мкг вреакции) + ДНКуз 50 фг в реакции; 3,4 - ДНК, выделенная из трипсинолизированной АФС гистона(количество белка 10 мкг в реакции);5,6 – ДНКуз 50 фг в реакции. В реакции 1,3,5 добавлено 3% ДМСО. В)Кривые плавления продуктов амплификации.Провели секвенирование двух продуктов рассматриваемой реакции. Для этогоамплифицировали продукт из субстанции гистона Н1.3, а также провели амплификациюположительного контроля - ДНКуз.
После чего из реакционной смеси была выделена ДНКидоведенадонеобходимойдлясеквенированияконцентрации.Результатысеквенирования оценивали при помощи программы Sequencing Analysis 5.2.0., чтовыявило наличие а АФС гистона Н1.3 двух продуктов ПЦР реакции, один из которыхсоответствовал контролю - ампликону 425 п.о., природа второго продукта быланеизвестна (рис. 45)94Рисунок 45. А) Результаты секвенирования продукта реакции рвПЦР при использовании АФС гистона Н1.3и праймеров к фрагменту гена 16S RNA E.coli.
размером 425 п.о. В) Результаты секвенирования продуктареакции рвПЦР при использовании РСО гистона Н1.3 (положительный контроль) и праймеров к фрагментугена 16S RNA E.coli. размером 425 п.о.Наличие дополнительного продукта в АФС гистона Н1.3 объясняет превышениесодержания остаточной ДНК в сравнении с контролем (табл.9). Провели оценкустабильности генома штамма-продуцента гистона Н1.3 путем отбора проб для рвПЦР вконтрольных точках: посевной материал, биомасса после ферментации, АФС гистонаН1.3, ГЛФ препарат Онкогист (серии 041012, 220912, 381212). Данные рвПЦРпредставлены в таблице 10.
Дополнительный продукт отсутствовал в посевном материалеи в биомассе, что говорит о чистоте клеточной культуры. При этом неспецифический пикбыл только в АФС гистона Н1.3 и отсутствовал в ГЛФ. Количество остаточной ДНКштамма-продуцента гистона Н1.3. в ГЛФ составило 4,8 ppb (серия 041012), 4,2 ppb (серия220912), 4,8 ppb (серия 281212), что соответствует нормативным требованиям.Аналогичный эксперимент был проведен для штамма-продуцента инсулина, в качествеГЛФ использовали препараты Инсуран Р (серия 010413), Инсулин гларгин (серия 020615),Инсулин аспарт (серия 080515). В отношении неспецифического пика получилиидентичные результаты.Таблица 10.Оценка пиков на кривых плавления рвПЦР с использованием SYBR GREEN I приопределении содержания остаточной ДНК штамма-продуцента гистона Н 1.3.НаименованиеПосевной материалБиомасса после ферментацииАФС гистона Н1.3ГЛФ препарат ОнкогистНаличие основногопика на кривыхплавления продуктоврвПЦР пика в области83,1°Св наличиив наличииотсутствуетв наличии95Наличие пика накривых плавленияпродуктов рвПЦР пикав области 79,0°Сотсутствуетотсутствуетв наличииотсутствуетНа рисунке 46 представлены результаты рвПЦР с использованием SYBR GREEN I дляДНКуз инсулина гларгин (серия 020615), праймеры к фрагменту гена 16S RNA E.coliразмером 425 п.о.
Пик на кривой плавления продуктов амплификации АФС имеетмаксимум в области 79°С, тогда как для продуктов амплификации биомассы и ГЛФмаксимумы пиков кривых плавления лежат в области 83,5°С. Данные для посевногоматериала совпали с результатами рвПЦР для биомассы после ферментации, то естьзначение С(t)=18 для 70 пг ДНКуз инсулина гларгин серии 020615, пики на кривыхплавления соответствовали ампликону размером 425 п.о.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
