Диссертация (1091787), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Программавыдает итоговое значение абсолютной концентрации остаточной ДНК – количество копийДНК в мкл. Коэффициент перечета для этого показателя в памяти прибора соответствует102значению остаточной ДНК E.coli. При этом, по мнению производителя прибора,построение калибровочных кривых не является обязательным. Но поскольку степеньфрагментации остаточной ДНК зависит от конкретных технологических стадий на этапеполучения АФС в рамках определенного производства, при анализе содержанияостаточной ДНК в субстанции методом кцПЦР калибровочная кривая для растворовразработанного РСО ДНКуз дает максимум информации.Согласно полученным данным, фоновая флуоресценция разработанного зонданаходится в пределах 4500 ед., при положительном отклике максимум флуоресценциисоставляет 16000 ед.
(рис. 53), соответственно разница между этими значениями 11500ед.. Значение фоновой флуоресценции коммерческого зонда лежит в пределах 2000 ед.,максимум флуоресценции при положительном отклике системы 8000 ед. (рис. 55),разницамеждууказаннымиразработаннымипраймерамизначениямиизондом6000ед.способнаСоответственно,производитьсигналкцПЦРсбольшейинтенсивности, в сравнении с кцПЦР при использовании коммерческих праймеров изонда.Рисунок 53. кцПЦР. Разработанные праймеры (размер ампликона 100 п.о.) и TaqMan зонд 16S-RealTime(5).Амплификация по программе 4. А) Зависимость амплитуды распределения положительных откликов(капель) от числа событий.
ДНКуз 225 пг в реакции (1); ДНКуз 4,5 пг в реакции (2); ДНКуз 0,45 пг в реакции(3); ДНКуз 45 фг в реакции (4); ДНКуз 22,5 фг в реакции (5); ДНКуз 2,25 фг в реакции (6); С – кластерыотрицательного отклика - вода, D – кластеры положительного отклика системы – остаточная ДНК/ДНКуз;В) Зависимость частоты от амплитуды распределения положительных откликов.103Рисунок 54. кцПЦР. Разработанные праймеры (размер ампликона 100 п.о.) и TaqMan зонд 16S-RealTime(5).Амплификация по программе 4. А) Зависимость амплитуды распределения положительных откликов(капель) от числа событий.
АФС гистона Н1.3 10 мкг в реакции (1); трипсинолизированная АФС гистонаН1.3 10 мкг в реакции (2); ДНКуз 50 фг в реакции (3); метод добавок - АФС гистона Н1.3 10 мкг в реакции +ДНКуз 50 фг в реакции (4); АФС гистона Н1.3 1 мкг в реакции (5); С – кластеры отрицательного отклика вода, D – кластеры положительного отклика системы – остаточная ДНК/ДНКуз; В) Зависимость частоты отамплитуды распределения положительных откликов.Рисунок 55.
кцПЦР. Коммерческие праймеры и TaqMan зонд. Амплификация по программе 4.А) Зависисмость амплитуды распределения положительных откликов (капель) от числа событий. АФСгистона Н1.3 10 мкг в реакции (1); трипсинолизированная АФС гистона Н1.3 10 мкг в реакции (2); ДНКуз 50фг в реакции (3); метод добавок - АФС гистона Н1.3 10 мкг в реакции + ДНКуз 50 фг в реакции (4); АФСгистона Н1.3 1 мкг в реакции (5); ДНКуз 450 пг в реакции (6); ДНКуз 9 пг в реакции (7); ДНКуз 0,9 пг вреакции (8); ДНКуз 90 фг в реакции (9); ДНКуз 45 фг в реакции (10); ДНКуз 4,5 фг в реакции (11); С –кластеры отрицательного отклика - вода, D – кластеры положительного отклика системы – остаточнаяДНК/ДНКуз; В) Зависимость частоты от амплитуды распределения положительных откликов.104В случае разработанного и коммерческого зонда наблюдалось ингибирование реакциисо стороны гистона Н1.3 в реакции с АФС, а таже в случае метода добавок (дорожки 1;4на рисунках 54 и 55).
В случае трипсинолизированной АФС гистона Н1.3, а также вслучае положительного контроля имел место очень слабый отклик (дорожки 2;3 нарисунках 54 и 55). Также наблюдался слабый отклик и при добавлении в реакциюразбавленной в 10 раз АФС гистона Н1.3 с концентрацией 1 мкг в реакции (дорожка 5 нарисунках 54 и 55). Разбавление субстанции, вероятно, снижает степень ингибированияреакции белком.
Но при проведении этой реакции в качестве положительного контролянеобходимо использовать ДНКуз с концентрацией 5 фг в реакции, это слишком маленькаяконцентрация для регистрации прибором достоверных измерений. При заявленномпроизводителем пределе обнаружения остаточной ДНК E.coli 10 фг.Согласно данным калибровочных кривых эффективность реакции для разработанныхпраймеров и зондов составила 0,96, для коммерческого набора 0,92 - при этом четковыделялся кластер неспецифики на дорожке 7 (рис.
55). Предел количественногоопределения при использовании разработанных праймеров и флуоресцентного зондасоставил 125 фг ДНКуз, для коммерческих праймеров и зонда этот показатель имелзначение 95 фг (при предельно допустимой концентрации остаточной ДНК 50 фг). Тоесть, для корректного определения количества остаточной ДНК и дальнейшейинтерпретации данных необходимо одновременно с оптимизацией методики увеличитьколичество ДНКуз - положительного контроля в одной реакции минимум в 2-3 раза с 50фг до 100 – 150 фг.
Но при этом количество вносимого белка в реакцию увеличится с 10мкг в реакции до 20 и 30 мкг соответственно, что создаст дополнительный рискингибирования кцПЦР.Минусом кцПЦР является тот факт, что после регистрации данных в ридере капельпробы не сохраняются, перемещаясь в общий слив. Что делает невозможным проведениеанализа продуктов реакции в агарозном геле при помощи горизонтального электрофореза,с целью установления размеров ампликонов. Поэтому при планировании экспериментаследует учитывать дополнительное количество дублей.Таким образом, устранение белка из реакции на этапе пробоподготовки являетсяоптимальным решением как для рвПЦР, так и для кцПЦР. Затраты на проведение анализаодной серии субстанции данным методом значительно превышают затраты для рвПЦР.Поэтому на данном этапе был сделан выбор в пользу применения рвПЦР (TaqMan/SYBRGREEN I).1052.
Оценка параметров метода рвПЦР при использовании SYBR GREEN Iи технологии TaqMan. Выбор оптимальной методики для рутинногоконтроля содержания остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli вАФС.Проведенные исследования показали, что чувствительность разработанных методикрвПЦР с использованием SYBR GREEN I и технологии TaqMan сопоставимы. Прииспользовании праймеров к ампликону размером 100 п.о. показатель порогового циклафлуоресценции для АФС инсулина и гистона Н1.3 при использовании SYBR GREEN Iсоставляет 18,8 и 32,0 соответственно. В случае TaqMan при использовании этих жепраймеров и наиболее чувствительного зонда RealTime(5) 5' FAM - ATA CCG CAT AACGTC GCA AGA CCA AAG- BHQ1 - 3' показатель C(t) составил 19,6 в случае инсулина и33,0 в случае гистона Н1.3. Приведенные данные говорят о том, что TaqManдемонстрирует меньшую чувствительность по сравнению с SYBR GREEN I, хотя при этомэффективности обоих типов реакций имели значение 2 (100%).Основными преимуществами метода TaqMan, относительно SYBR GREEN является егоспецифичность, возможность проведения нескольких реакций в одной смеси (напримеродновременное определение содержания плазмидной и геномной ДНК штаммапродуцента в АФС), меньший риск контаминации, большая точность при малыхколичествах субстрата.
Несмотря на преимущества TaqMan, при помощи SYBR GREEN Iможно оценить температуру плавления продукта реакции. Это важно, поскольку разницатемпературы плавления ампликона положительного контроля и ампликона исследуемойсубстанции может говорить о синтезе другого продукта, отличного от ампликона вконтроле. Что было продемонстрировано при анализе остаточной ДНК штаммапродуцента в АФС гистона Н1.3 при использовании праймеров к ампликону размером 425п.о.
Кроме того метод с SYBR GREEN I прост в оптимизации для рутинных исследований.Поскольку в случае низкой чувствительности TaqMan зонда, необходимо разработать исинтезировать новый, это дополнительные затраты времени и средств. Затраты напроведение анализа складываются из стоимости реактивов и готовых наборов дляпроведения методики. Для методики с SYBR GREEN I затраты для анализа одной серииАФС значительно меньше соответствующих для технологии TaqMan. Для кцПЦР наоснове технологии TaqMan затраты на проведение методики на порядки больше, всравнении с использованием рвПЦР SYBR GREEN I.
Это связано с необходимостьюдополнительных затрат на расходные материалы: картриджи для получения эмульсии,плашки специального типа, химически устойчивые к реакционной смеси для кцПЦР.106Таким образом, для целей данного исследования был сделан выбор в пользу методикирвПЦР с использованием SYBR GREEN I.3. Сопоставление показателей разработанной методики рвПЦР наоснове SYBR GREEN I и параметров коммерческого набора фирмы CygnusTechnologies по определению остаточной ДНК штамма-продуцентаE.coli в АФС генно-инженерного инсулина человека и генно-инженерногогистона Н1.3 человека.Была проведена оценка содержания остаточной ДНК E.coli в АФС инсулина и гистонаН1.3 при использовании стандартов и праймеров коммерческого набора на основе SYBRGREEN I (рис.
56), DNA Extraction and Amplification Kit for the Measurement of ResidualE.coli Host Cell DNA (#D415T, Cygnus Technologies).Рисунок 56. рвПЦР (SYBR GREEN I) A) Калибровочная кривая для праймеров Cygnus, количествостандартов из набора в реакции: 100 пг; 10 пг; 1 пг; 0,1 пг; 0,01 пг; 0 пг. Программа амплификации,рекомендованная производителем: 95ºС 10 мин; 45 циклов: 95ºС 15 сек, 55ºС 60 сек. На калибровкеотмечены точки, соответствующие C(t) для остаточной ДНК АФС инсулина и гистона Н1.3.B)Электрофореграмма в 1,5% агарозном геле продуктов рвПЦР по прошествии 45 циклов: 1 – вода; 2,3 –остаточная ДНК, выделенная из 10 мкг инсулина/ в реакции; 3,4– остаточная ДНК, выделенная из 10 мкггистона Н1.3/ в реакции; 7 – стандарт из набора 100 пг/ в реакции; 8 - стандарт из набора 0,1 пг/ в реакции, 8– маркер молекулярных весов.Эффективность реакции составила 1,95 (рис 56А). Провели электрофорез в 1,5 %агарозном геле. Размер ампликона составил около 150-160 п.о.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
