Диссертация (1091787), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Для ампификациииспользовали следующие программы. Программа 2: 95ºС 5 мин; 45 циклов: 95ºС 30 сек,60ºС 60 сек. Программа 3: 95ºС 5 мин; 45 циклов: 95ºС 30 сек, 58ºС 40 сек. Результатыоценивали при помощи программы Real_Time PCR v7.5, а также горизонтальногоагарозного электрофореза и визуализации в УФ диапазоне.TaqMan кцПЦР с праймерами и TaqMan зондом к геномной ДНК E.coli изкоммерческого набора One-Step RT-ddPCR Kit for Probes (#1863021, BIO-RAD, США)проводили на приборе Droplet Digital PCR system QX100 (BIO-RAD, США). Вреакционную смесь объемом 20 мкл входили: ddPCR™ Supermix for Residual DNAQuantification (2X) (#1864037, BIO-RAD, США), 1 мкл праймеров и TaqMan зондовкоммерческого набора One-Step RT-ddPCR Kit for Probes (#1863021, BIO-RAD, США).При этом концентрация праймеров составила 18 пмоль в реакции (0,9 мкМ), TaqManзонда 5 пмоль в реакции (0,25 мкМ).
В лунки картриджа вносили образец объемом 20 мкл,затем в параллельные лунки вносили по 70 мкл масла для создания эмульсии из набораDroplet Digital™ PCR Oils (BIO-RAD, США), затем картридж помещали в генераторкапель и получали эмульсию. После чего 32 мкл эмульсии переносили в лунки 9681луночной плашки, которую накрывали фольгой и прочно ее запаивали. Для ампификациииспользовали прибор Thermal Cycler T100 (BIO-RAD, США). Реакцию вели по программе4, рекомендованной производителем набора: 95 ºС 10 мин, 95 ºС 15 сек, 54 ºС 1 мин, 40циклов, финальная стадия 98 ºС 10 мин.
После чего плашку помещали в ридер капель ипроводили измерения. Анализ результатов осуществляли при помощи программыQantaSoft 1.7.1 (BIO-RAD, США).TaqMan кцПЦР с разработанными праймерами и TaqMan зондом к геномной ДНК сразработанными праймерами к 16S RNA E.coli проводили на приборе Droplet Digital PCRsystem QX100 (BIO-RAD, США). В реакционную смесь объемом 20 мкл входили:ddPCR™ Supermix for Residual DNA Quantification (2X) (#1864037, BIO-RAD, США), 1мкл разработанных праймеров и TaqMan зондов При этом концентрация праймеровсоставила 0,9 мкМ, TaqMan зонда 0,25 мкМ. В лунки картриджа вносили образец объемом20 мкл, затем в параллельные лунки вносили по 70 мкл масла для создания эмульсии изнабора Droplet Digital™ PCR Oils (BIO-RAD, США), затем картридж помещали вгенератор капель и получали эмульсию. После чего 32 мкл эмульсии переносили в лунки96-луночной плашки, которую накрывали фольгой и прочно ее запаивали.
Дляампификации использовали прибор Thermal Cycler T100 (BIO-RAD, США). Реакцию велипо программе 4, рекомендованной производителем набора, с учетом температур отжигаразработанных праймеров и TaqMan зонда: 95 ºС 10 мин, 95 ºС 15 сек, 54 ºС 1 мин, 40циклов, финальная стадия 98 ºС 10 мин. После чего плашку помещали в ридер капель ипроводили измерения. Анализ результатов осуществляли при помощи программыQantaSoft 1.7.1 (BIO-RAD, США).2.1.6. Подготовка образцов к секвенированию.Необходимое количество продукта было накоплено при помоща ПЦР в объеме 50 мкл(Thermal Cycler T100, BIO-RAD). В реакции использовали праймеры к фрагменту гена 16SRNA E.coli , размер ампликона 425 п.о., высокоточную Iproof полимеразу, котораяработает в 52 раза точнее Taq полимеразы (Iproof High-Fidelity DNA Polymerase, BIORAD).
Продукты реакции подвергли горизонтальному электрофорезу в 1,5% агарозномгеле. Провели очистку смеси от полимеразы и компонентов реакционной смеси, выделивДНК при помощи коммерческого набора DNA Extraction and Amplification Kit for theMeasurement of Residual E.coli Host Cell DNA (#D415T, Cygnus Technologies, США). Послечего полученные растворы передали ДНК на секвенирование в ЗАО «Евроген».822.2.
Определение содержания проинсулина в АФС инсулина методомELISA.Валидационные параметры методики твердофазного иммуноферментного анализа(ИФА), в основе которого лежит сандвич-метод ELISA, оценивали при помощикоммерческихнаборов«ПанкреоИФА-проинсулин»(ЗАО«АлкорБио»,Россия),предназначенного для определения проинсулина в субстанции генно-инженерногоинсулина человека, и набора «Proinsulin ELISA» (DRG InstrumentGmbH, Германия),рекомендуемого для определения проинсулина в сыворотке и плазме. Все операциипроводили согласно протоколам производителей.2.2.1.
Буфер для проб (Отрицательный контроль).В микропробирку вносили 5мл 0,01М HCl и 0,375 мл 3М Трис с 2M NaCl(5мл·0,075=0,375 мл), использовали свежеприготовленный буфер.2.2.2. Пробоподготовка АФС инсулинаНавеску АФС инсулина 7 мг растворяли в 700 мкл 0,01 М HCl, затем приливали 52,5мкл буфера 3М Трис с 2M NaCl. Полученный раствор инсулина разбавляли в 1/20буфером до концентрации белка 0,46 мг/мл. В лунку планшета вносили 10 мклполученного раствора.83IV.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ1. Разработка метода рвПЦР для определения остаточной ДНКштамма-продуцента E.coli, на примере промышленных серий АФС генноинженерного инсулина человеческого и генно-инженерного гистона Н1.3человеческого.Для контроля степени чистоты и качества АФС необходимо развитие современныхчувствительных методов определения специфических примесей, таких как остаточныебелки и ДНК клеток-хозяина. Количество ДНК в АФС, предназначенных дляпроизводства инъекционных препаратов не должно превышать 10 нг на терапевтическуюдозу, согласно требованиям руководств ЕФ, FDA, ICH и WHO, а также согласно ФСП РN002254/01-081209. Соответственно, не более 7-10 нг на 1 мг сухого вещества (7-10 ppm)для генно-инженерного инсулина.
Для рекомбинантного гистона Н1.3 это значениесоставляет не более 5 пг на 1 мг сухого вещества (5 ppb).1.1. Создание рабочего стандартного образца на основе тотальной ДНКштамма-продуцента инсулина.Вследствие прохождения выделяемым продуктом множества технологических стадий,остаточная ДНК штамма-продуцента, присутствующая в фармацевтической субстанции,является гетерогенным материалом.
Это «обрывки», фрагменты одно- и двухцепочечнойДНК, образовавшиеся в результате проведения технологического процесса, начиная отразрушения клеток штамма-продуцента до финишной очистки получаемого продукта. Сцелью создания рабочего стандартного образца (РСО) для метода рвПЦР тотальную ДНКштамма-продуцента инсулина (ДНКт) обработали ультразвуком в течение 10 мин, такжепараллельно тотальную ДНК инкубировали с ДНКазой I при 37 ºС в течение 15 мин (1,5ед.
ДНКазы на 1 мкг ДНКт). Затем результаты визуализировали при помощи Дотблоттинга (рис 34А), а также оценивали степень разрушения ДНК при помощигоризонтального агарозного электрофореза (рис. 34В). Для штамма-продуцента гистонабыли получены идентичные результаты. Размер ДНКт составил 2000-3000 п.о., ДНКуз 80600 п.о., ДНКф не удалось визуализировать вследствие ее сильной фрагментации.84Рисунок 34.
А) Метод гибридизации (Дот-блот). На нейлоновую мембрану и в реакционную смесь для ПЦРвносили одинаковое количество ДНКт, ДНКуз и ДНКф штамма-продуцента инсулина – 10 нг, 3 нг, 1 нг, 0,3нг и 0,1 нг. В) Электрофоретический анализ в 1,5% агарозном геле 2 нг ДНК инсулина в присутствии этидиябромида: 1 – Маркер молекулярных весов; 2 – ДНКт; 3- ДНКуз (10 мин обработки ультразвуком); 4 – ДНКф.В ходе оптимизации методики создания РСО тотальную ДНК обрабатывалиультразвуком в течение разных промежутков времени.
Степень разрушения тотальнойДНКштамма-продуцента гистона 1.3 оценивалиприпомощигоризонтальногоэлектрофореза в 1,5 % агарозном геле. На рисунке 35 представлена электрофореграммадля ДНК штамма-продуцента гистона 1.3. Данные позволили заключить, что дляполучения РСО подходит методика обработки ультразвуком ДНК в течение 10 мин,поскольку этого периода времени достаточно для получения образца с максимальнойстепенью разрушения. Электрофоретическая картина идентична для проб после 10-тиминутной и 15-ти минутной обработки ультразвуком.Рисунок 35. Электрофоретический анализ в 1,5% агарозном геле 2 нг ДНК штамма-продуцента гистонаН1.3 в присутствии этидия бромида: 1 – ДНКф; 2 – ДНКт; 3- ДНКуз (5 мин обработки ультразвуком); 4 –ДНКуз (10 мин обработки ультразвуком); 5 – ДНКуз (15 мин обработки ультразвуком); 6 –Маркермолекулярных весов.851.2.
Оптимизация пробоподготовки АФС для определения остаточнойДНК штамма-продуцента методом рвПЦР.Для образцов АФС инсулина пробоподготовка сводится к получению растворасубстанции в 10–20 мМ Трис-HCl буфере рН 7,0–8,0. Причем чувствительность методарвПЦР позволяет использовать раствор с низкой концентрацией тестируемой субстанции(до 10 мкг/мл), что особенно хорошо для генно-инженерных белковых препаратов,склонных к агрегации и выпадению в осадок в отсутствие стабилизирующих веществ(детергентов, консервантов и др.). Это является явным преимуществом примененияметода рвПЦР для АФС.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
