Диссертация (1091787), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Объекты исследованияВ качестве объекта исследований были выбраны 28 серий АФС генно-инженерногоинсулина человеческого и 23 серии АФС генно-инженерного гистона Н1.3 человеческого,6 серий рекомбинантного инсулина Аспарт, 6 серий рекомбинантного инсулина Гларгин,полученные на ОБП ИБХ РАН.
Для выделения тотальной ДНК были использованыштаммы-продуценты инсулина E.Coli BL21(DE3)/pINS07 - Патент №2267534, инсулинаАспарт E.Coli BL21/pAS-2 (BAS2) - Патент №2337964, инсулина Гларгин E.ColiBL21/pGG-1(BGG18) - Патент №2325440, разработчик штаммов ИБХ РАН, депонированыв музее штаммов-продуцентов ОБП ИБХ РАН), гистона Н1.3 E.coli BL21/prhH1.3(получен от ЗАО «Крионикс», РФ), а также высокопродуктивной стабильной клеточнойлинииhuFSHIK,секретирующейрекомбинантныйчеловеческийФСГ(фолликулостимулирующий гормон), на основе линии СНО К1 DXB11 (№2012106207,разработчики ООО «Фармако Биотех», ООО «Фармбиотех», ИБХ РАН), Pichia pastorisYeast Strain GS115 (#C181-00, Invitrogen).Коммерческие наборы: для рвПЦР DNA Extraction and Amplification Kit for theMeasurement of Residual E.coli Host Cell DNA (#D415T, Cygnus Technologies), MaximaSYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X)(Thermo Scientific, США), для кцПЦР ddPCRSupermix for residual DNA Quantificaton (#1864037, BIO-RAD, США), праймеры ифлуоресцентные пробы One-Step RT-ddPCR Kit for Probes (#1863021, BIO-RAD, США),для ИФА «Proinsulin ELISA» (#EIA-1560, DRG InstrumentGmbH, Германия) и«ПанкреоИФА-проинсулин» (ЗАО «АлкорБио», Россия).Условия амплификации: Программа 1: 95ºС 5 мин; 35 циклов: 95ºС 30 сек, 50ºС-70ºС30 сек; 72ºС 20 сек.
Затем 72ºС 3 мин. Программа 2: 95ºС 5 мин; 45 циклов: 95ºС 30 сек,60ºС 60 сек. Программа 3: 95ºС 5 мин; 45 циклов: 95ºС 30 сек, 58ºС 40 сек. Программа 4:95 ºС 10 мин, 95 ºС 15 сек, 54 ºС 1 мин, 40 циклов, финальная стадия 98 ºС 10 мин.Праймеры для ампликонов размером: 252 п.о.: Blaf-534 5’-GAT GCT TTT CTG TGACTG GTG-3’; Blaref-765 5’- ACG CTG GTG AAA GTA AAA GAT-3’. 79 п.о.: 16S-FN 5'77GGG ATA ACT ACT GGA AAC GGT -3'; 16S-REWnew 5' - ATG GGC AAG AGG CCCGAA - 3'. 123 п.о.: 16S-FORW 5' - GTG GCG GAC GGG TGA GTA - 3'; 16S-REWnew 5' ATG GGC AAG AGG CCC GAA - 3'.
179 п.о.: 16S-FORWnew 5' - CCT AAC ACA TGCAAT GTC GAA - 3'; 16S-REWnew 5' - ATG GGC AAG AGG CCC GAA - 3'. 425 п.о.: 16SFORW 5' - GTG GCG GAC GGG TGA GTA - 3'; 16Sa-REW 5'- GGC TGC TGG CAC GGAGTT -3'. 911п.о.: 16S-FN 5'- GGG ATA ACT ACT GGA AAC GGT -3'; 16S-RN 5'- CATGCA GCA CCT GTC TCA CA -3'. 198 п.о.: 16S-FORWnew(1) 5' – CCT AAC ACA TGC AAGTC GAA C- 3'; 16S-REWnew(1) 5' – AAT CCC ATC TGG GCA CAT CC – 3'.
100 п.о.:16S-FN 5'- GGG ATA ACT ACT GGA AAC GGT -3'; 16S-REWnew(1) 5' – AAT CCC ATCTGG GCA CAT CC – 3'.TaqMan зонды: 16S-RealTime(1) 5' R6G- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA –BHQ2 - 3'; 16S-RealTime(2) 5' FAM- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA – RTQ1 3'; 16S-RealTime(3) 5' FAM- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA – BHQ1 - 3'; 16SRealTime(4) 5' FAM- CTA ATA CCG CAT(BHQ1) AAC GTC GCA AGA - 3'; 16SRealTime(5) 5' FAM - ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA CCA AAG- BHQ1 - 3'.2. Методы исследования2.1.
Определение остаточной ДНК штамма-продуцента в АФС инсулинаи гистона Н1.3.2.1.1. Наращивание биомассы.Работу проводили под ламинаром в зоне пламени горелки. Образец культурырекомбинантного штамма E.coli при помощи микробиологической петли рассевалиштрихом на LB-агар, с добавлением ампициллина 100 мкг/мл (условия выращивания 37°С15-16 часов). Затем отдельные колонии вносили в жидкую среду LB-бульон, сдобавлением ампициллина 100 мкг/мл, культивировали при постоянном покачивании втечение 15-16 часов при температуре 37°С, охлаждали во льду в течение ~30 минут, затемцентрифугировали при 4000 об/мин в течение 30 минут, удаляли супернатант, осадокисользовали для выделения ДНК.2.1.2.
Выделение тотальной и плазмидной ДНК.Тотальную ДНК выделяли следующим образом. 1 г биомассы ресуспендировали в 20мл буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,5 мМ ЭДТА и лизоцим 10-50 мкг/мл.К просветленной суспензии добавляли 1/10 объёма 10% SDS, полученный лизатперемешивали и встряхивали с равным объёмом смеси водонасыщенного фенола (рН 8,0)и хлороформа (1:1, по объему). Водный слой, содержавший ДНК, отделяли78центрифугированием и повторно обрабатывали свежей порцией фенол-хлороформа. ДНКиз экстрактов концентрировали осаждением из этанола и растворяли до рабочейконцентрации 5 мг/мл в однократном ТЕ буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0).
ТотальнуюДНК из субстанции выделяли при помощи коммерческого набора DNA Extraction andAmplification Kit for the Measurement of Residual E.coli Host Cell DNA (#D415T, CygnusTechnologies, США). Плазмидную ДНК выделяли наборами “Plasmid Miniprep” (Evrogen,РФ), согласно протоколам производителей.Концентрацию ДНК в получены растворах измеряли спектрофотометрически припомощи планшета NanoQuant (Tecan Infinite F200pro, Швейцария) в объеме 2 мкл.
Приэтом одновременно оценивали качество препарата ДНК путем измерением соотношения260/280 нм. Также чистоту полученного раствора оценивали электрофоретически в 1,5%агарозном геле в присутствии этидия бромида (Panreac, США).2.1.3. Обработка ДНК ультразвуком, ДНКазой.С целью создания рабочего стандартного образца тотальную ДНК обрабатывалиультразвуком в течение 5; 10 и 15 мин (Sonicator W-10, Head System Ultrasonic, США).При этом пробирки помещали в лед. Также параллельно тотальную ДНК обработывалиДНКазой I при 37ºС в течение 15 мин (1,5 ед.
ДНКазы на 1 мкг ДНКт). Затем оценивалистепень разрушения ДНК при помощи Саузерн-блоттинга – дот-гибридизации срадиоактивным фосфором P32 на нейлоновой мембране (Hybond-N, Amersham), а такжегоризонтального агарозного электрофореза (система «SE-2», Helicon, Россия) ивизуализации в УФ диапазоне при помощи гель-документирующего устройства (VilberLourmat, Франция) в присутствии SYBR GREEN I (ApplyChem Panreac, Германия). Длянанесения образцов на гель использовали 6X MassRuler DNA Loading Dye (Fermentas,США). В качестве маркера использовали FastRuller Low Range DNA Ladder (Fermentas,США).Рабочий раствор тотальной и плазмидной ДНК E.coli для количественной оценкирезультатов анализа готовили последовательными 10-кратными разведениями стоковыхрастворов до необходимой концентрации, со спектрофотометрическим контролем вобъеме 2 мкл на планшете NanoQuant (Tecan Infinite F200pro, Швейцария).2.1.4.
Пробоподготовка АФС.Определение остаточной ДНК в АФС инсулина при помощи метода ПЦР по конечнойточке не требует устранения белка из реакционной смеси. Для рвПЦР белок устраняют из79реакции, при помощи коммерческого набора DNA Extraction and Amplification Kit for theMeasurement of Residual E.coli Host Cell DNA (#D415T, Cygnus Technologies, США).Буфер для проб АФС инсулина (Отрицательный контроль).В микропробирку вносили 5мл 0,01М HCl и 0,375мл 3М Трис с 2M NaCl(5мл·0,075=0,375мл), использовали свежеприготовленный буфер.Пробоподготовка АФС инсулинаНавеску АФС инсулина 7 мг растворяли в 700 мкл 0,01 М HCl, затем приливали 52,5 мклбуфера 3М Трис с 2M NaCl.
Полученный раствор инсулина разводили буфером для пробдо концентрации 2 мкг/мкл.С целью разрушения комплекса ДНК с гистоном проводили гидролиз АФС гистонаН1.3 трипсином, Sigma, США (термостат Heraeus, Германия). Комплекс разрушали припомощи гидролиза АФС трипсином, при различном соотношении фермент:белок (1:10;1:100; 1:1000). Оптимальное соотношение фермент:белок 1:100. Инкубацию с ферментомпроводили в течение 1, 2 и 4 часов при температуре 37 ºС. Результаты триптическогогидролиза анализировали при помощи вертикального электрофореза в ПААГ по Лэммли вприсутствии додецилсульфата натрия и β-меркаптоэтанола (система Mini-PROTEAN TetraSystem, BIO-RAD, США).
Были выбраны маркеры молекулярных весов: окрашенныйPageRuler Plus Prestained Protein Ladder, а также неокрашенный более узкого диапазонаUnstained Protein MW Marker (Thermo Scientific, США). На следующем этапе остаточнуюДНК из субстанции выделяли при помощи коммерческого набора DNA Extraction andAmplification Kit for the Measurement of Residual E.coli Host Cell DNA (#D415T, CygnusTechnologies, США).2.1.5. Проведение ПЦР и рвПЦР на основе интеркалирующего красителяSYBR GREEN I и технологии TaqMan, основанной на введении вреакцию флуоресцентно-меченых зондов.Температуру отжига праймеров к фрагменту гена 16S RNA E.coli для ампликоновразного размера подбирали на ПЦР амплификаторе Thermal Cycler T100 (BIO-RAD,США).
Использовали стерильную воду для ПЦР, Евроген. В реакционную смесь объемом25 мкл входили: ПЦР-буфер (70 мM Трис-HCl, pH 8,6 / 25 C, 16,6 мM (NH4)2SO4, 2,0 мMMgCl2), 2,0 мМ dNTPs, праймеры 0,2 мкМ, 0,2 ед. в реакции HS Taq-полимеразы 5ед./мкл). Условия амплификации, программа 1: 95ºС 5 мин; 35 циклов: 95ºС 30 сек, 50ºС70ºС 30 сек; 72ºС 20 сек. Затем 72ºС 3 мин. Результаты оценивали при помощигоризонтального агарозного электрофореза и визуализации в УФ диапазоне.рвПЦР в присутствии (SYBR Green I) с разработанными праймерами к 16S RNA E.coliпроводили на приборе «DT96» («ДНК-технологии», Россия). В реакционную смесь80объемом 25 мкл входили: ПЦР смесь Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2X)(Thermo Scientific, США), праймеры 5 пмоль в реакции (0,2 мкМ).
Для ампификациииспользовали следующие программы. Программа 2: 95ºС 5 мин; 45 циклов: 95ºС 30 сек,60ºС 60 сек. Программа 3: 95ºС 5 мин; 45 циклов: 95ºС 30 сек, 58ºС 40 сек. Результатыоценивали при помощи программы Real_Time PCR v7.5, а также горизонтальногоагарозного электрофореза и визуализации в УФ диапазоне.рвПЦР в присутствии (SYBR Green I) с праймерами из набора DNA Extraction andAmplification Kit for the Measurement of Residual E.coli Host Cell DNA (#D415T, CygnusTechnologies, США) проводили на приборе «DT96» («ДНК-технологии», Россия). Вреакционную смесь объемом 25 мкл входили: ПЦР смесь Maxima SYBR Green/ROX qPCRMaster Mix (2X)(Thermo Scientific, США), праймеры 5 пмоль в реакции (0,2 мкМ).Условия амплификации, согласно руководству к набору.
95ºС 10 мин; 45 циклов: 95ºС 15сек, 55ºС 60 сек. Результаты оценивали при помощи программы Real_Time PCR v7.5, атакже горизонтального агарозного электрофореза и визуализации в УФ диапазоне.TaqMan рвПЦР с разработанными праймерами к геномной и плазмидной ДНК E.coliпроводили на приборе «DT96» («ДНК-технологии», Россия). Использовали стерильнуюводу для ПЦР, Евроген. В реакционную смесь объемом 25 мкл входили: ПЦР-буфер (70мM Трис-HCl, pH 8,6 / 25 C, 16,6 мM (NH4)2SO4, 2,0 мM MgCl2), 2,0 мМ dNTPs, праймеры10 пмоль в реакции (0,4 мкМ), концентрация разработанного TaqMan зонда 3,75 пмоль вреакции (0,15 мкМ), 0,2 ед. в реакции HS Taq-полимеразы 5 ед./мкл).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
