Диссертация (1091787), страница 19
Текст из файла (страница 19)
При оценке количественного содержания ДНК в исследуемомобразце по полученным стандартным кривым РСО необходимо убедиться, чтоэффективность рвПЦР для РСО и искомой ДНК примерно одинаковы. Для этогоиспользовали метод добавок, в образцы субстанции инсулина серий 110908, 050209(образец 1 и 2), содержащие 10 мкг белка, было внесено по 70 пг ДНКуз (рис.36).Сопоставление полученных данных по определению ДНК в образцах с добавлениемизвестных количеств стандартных растворов плазмидной и геномной ДНК, обработанныхультразвуком, дало совпадающие результаты.
Следовательно, наличие большогоколичества белка или других ингредиентов в пробе не препятствует количественномуопределению ДНК в АФС инсулина. То есть предложенный метод не требуетпредварительной пробоподготовки и ее стандартизации для получения достоверногорезультата.Рисунок 36. Электрофореграмма в 1,5% агарозном геле продуктов рвПЦР в присутствии SYBR GREEN I.Метод добавок рвПЦР, праймеры к плазмидной ДНК, размер ампликона 252 п.о., программа 1 притемпературе отжига 58ºС: 1;2 – вода; 3;4 – АФС инсулина 10 мкг, серии 110908, 050209 соответственно; 5;6- АФС инсулина 10 мкг, серии 110908, 050209 соответственно + ДНКуз инсулина 70 пг ; 7;8 – ДНКузинсулина 70 пг; 9 – маркер молекулярных весов.Особенность строения гистонов обуславливает формирование их прочного комплекса смолекулами ДНК.
Что затрудняет анализ содержания остаточной ДНК штаммапродуцента в АФС. Поэтому для определения количеств ДНК порядка 10-12-10-15г86необходима высокая чувствительность методики и особая пробоподготовка для АФСгистона Н1.3. Применение набора Cygnus для экстракции ДНК из субстанции гистонаН1.3 не дало нужного результата. В ходе выделения происходило образование комплексаДНК-белок, при этом реакция ПЦР не протекала вследствие отсутствия свободногосубстрата ДНК в реакционной смеси (рис.
37А). Комплекс разрушили при помощигидролиза АФС трипсином, при различном соотношении фермент:белок (1:10; 1:100;1:1000). Оптимальное соотношение фермент:белок составило 1:100. Поскольку присоотношении 1:1000 триптический гидролиз проходил не полностью, при соотношениифермент:белок 1:100 и 1:10 имела место картина полного гидролиза. Но при показателе1:10 в конечном счете в пробирке присутствует большее количество трипсина (всравнении с 1:100), который также требует устранения на этапе выделения ДНК.Инкубацию с ферментом проводили в течение 1, 2 и 4 часов при температуре 37 ºС.Результаты трипсинолиза оценили при помощи электрофореза в ПААГ по Лэммли вденатурирующих условиях.
Полученные данные указывают на то, что для эффективноготрипсинолиза достаточно 1 часа инкубации гистона Н1.3 с ферментом (рис. 37В).В)А)Рисунок 37. Данные для штамма-продуцента гистона Н1.3. А) Электрофореграмма в 2,5% агарозном гелепродуктов ПЦР для фрагмента 425 п.о. в присутствии этидия бромида. Программа 2.
Метод добавок,концентрации в реакции: 1 – вода; 2 – ДНК, выделенная набором Cygnus из 10 мкг АФС гистона Н1.3; 3ДНК гистона Н1.3 50 фг; 4 - ДНК, выделенная набором Cygnus из 10 мкг АФС гистона Н1.3 + ДНК гистонаН1.3 50 фг; 5 - ДНК, выделенная набором Cygnus из 10 мкг трипсинолизированной АФС гистона Н1.3; 6 ДНК, выделенная набором Cygnus из 10 мкг трипсинолизированной АФС гистона Н1.3 + ДНК гистона Н1.350 фг; 7 - ДНКт гистона Н1.3 2 нг. В) Электрофореграмма в 12% ПААГ АФС гистона Н1.3 до и послетрипсинолиза: 1 – Гистон Н1.3 4 мкг; 2,3,4 – Гистон Н13. после обработки трипсином в течение 1,2,4 часовсоответственно, 40 мкг АФС.На последующем этапе пробоподготовки из трипсинолизированной субстанциивыделили ДНК при помощи набора Cygnus. Для подтверждения оптимальности методапробоподготовки использовали метод добавок для ПЦР.
В пробирки вносили 10 мкг АФСгистона Н1.3; ДНК, экстрагированную при помощи набора Cygnus из АФС, а также ДНК,экстрагированную при помощи набора Cygnus из трипсинолизированной АФС. К87вышеуказанным субстанциям добавляли 50 фг тотальной ДНК (ДНКт) гистона Н1.3 (рис.37А). Метод добавок показал оптимальность этапов пробоподготовки, при использованиистадии трипсинолиза.1.3. Подбор компонентов и условий проведения реакций рвПЦР сиспользованием SYBR GREEN I и технологии TaqMan.1.3.1.
рвПЦР с использованием SYBR GREEN I.Применение ПЦР и рвПЦР позволяют выявлять одно- и двухцепочечные фрагментыДНК размером равным и большим выбранному для амплификации фрагменту. Ранее былразработан метод рвПЦР по количественному определению плазмидной ДНК в АФСинсулина. С применением праймеров к гену β-лактамазы (bla-ген устойчивости кампициллину), проводили амплификацию нуклеотидного фрагмента размером 252 п.о.Для разработки праймеров был выбран консервативный фрагмент гена 16S РНК E.coliразмером 1000 п.о. При помощи пакета программ Vector NTI Advance 11.5.1 разработалипраймеры к фрагментам гена 16S РНК E.coli размером 79 п.о, 123 п.о, 179 п.о., 425 п.о.,911 п.о. (рис.
38).Рисунок 38. Карта праймеров и флуоресцентных зондов TaqMan к фрагменту гена 16S РНК E.coli.На начальном этапе провели оптимизацию температурного режима реакции, для этогорассмотрели динамику наращивания ПЦР продуктов размером 79 п.о, 123 п.о, 179 п.о. приразличных температурах отжига праймеров, в диапазоне от 50°С до 70°С. (программа 1), витоге была выбрана оптимальная температура отжига 58 °С, время отжига и элонгациисоставило 40 сек (программа 3).Для рвПЦР важным параметром является C(t) - значение порогового циклафлуоресценции. Поэтому при оптимизации реакции следует учитывать, что указанноезначение не должно превышать 33, поскольку при выходе кривой накопления продуктареакцииприбольшемзначениипоказателяC(t)существуетвысокийрискнеспецифического отжига праймеров.
На рисунке 39 представлена электрофореграмма88продуктов ПЦР по конечной точке (с постепенным увеличением числе циклов реакции от25 до 45), которая демонстрирует появление неспецифических продуктов реакции впробирке с отрицательным контролем – водой. Указанные данные имеют отношение коптимизации ПЦР по конечной точке для определения остаточной ДНК в субстанцииинсулина при использовании праймеров к фрагменту гена 16S RNA E.coli, размерампликона 425 п.о.Рисунок 39.
Электрофореграмма в 1,5% агарозном геле продуктов ПЦР. Метод ПЦР по конечной точке.Диапазон числа циклов от 25 до 45, праймеры к геномной ДНК штамма-продуцента инсулина. Размерампликона 425 п.о.: 1 – вода; 2 – АФС инсулина 10 мкг, серия 091112; 3 - ДНКуз инсулина 70 пг ; 4;5 –маркер молекулярных весов.Наряду с оптимизацией таких параметров реакции, как температура отжига праймеров,количество циклов, необходимо учитывать вносимое количество основных компонентов:праймеров, ионов магния, дезоксирибинуклеотидтрифосфатов – dNTPs, Taq-полимеразы.Рекомендованная концентрация праймеров 0,1 - 0,5 мкМ, концентрация ионов магния 1,05,0 мМ, dNTPs – 2 мМ, Taq-полимеразы – 0,5 u в реакции.
После проведеннойоптимизации концентрации компонентов были следующие: концентрация праймеров 0,4мкМ (или 10 пмоль/в реакции 25 мкл), концентрация ионов магния 2,0 мМ, dNTPs – 2,0мМ, Taq-полимеразы – 0,2 u в реакции.На следующем этапе провели рвПЦР в присутствии красителя SYBR GREEN I.КалибровочныерастворыДНКузготовилипоследовательнымидесятикратнымиразведениями, со спектрофотометрическим контролем в объеме 2 мкл на планшетеNanoQuant (TECAN, Швейцария). В реакцию рвПЦР (SYBR GREEN I) внесли ДНКуз атакже праймеры к фрагментам гена 16S РНК E.coli разных размеров. Ампликон 911 п.о. напервом этапе показал самую низкую чувствительность (амплификация по программе 2),вследствие его большого размера и далее в работе не рассматривался.
Ампликон 425 п.о.показал наибольшую чувствительность в сравнении с остальными ампликонами(амплификация по программе 2). При этом на кривых плавления для 425 п.о. и 179 п.о.отсутствовали димеры праймеров (рис.40 В, D). В случае ампликонов 123 п.о., 79 п.о., накривых плавления есть пики, соответствующие димерам праймеров.89Рисунок 40. рвПЦР (SYBR GREEN I). A) График накопления ДНКуз гистона Н1.3, программа 2, праймеры кампликону 425 п.о., 2,5 пг ДНКуз в реакции. В) Кривая плавления продукта амплификации. Т пл425 п.о.–83,0°С. C) Графики накопления ДНКуз для ампликонов, программа 3, 1) 179 п.о.; 2) 123 п.о.; 3) 79 п.о.,праймеры к ампликонам 179 п.о., 123 п.о, 79 .о. соответственно.
D) Кривые плавления продуктовамплификации. 1) Тпл 179 п.о.= 81,1°С, 2) Тпл 123 п.о. = 78,8°С, 3) Тпл 79 п.о. = 77,4°С.Для оценки линейности калибровочных кривых проанализировали результаты 6параллельных определений для каждого из калибровочных растворов. В таблице 7рассчитаны средние значения порогового цикла флуоресценции (С(t)) для каждогоампликона. Значения внутрисерийного и межсерийного относительного стандартногоотклонения не превышали 5%.90Рисунок 41. Калибровочные кривые для результатов амплификации фрагментов 425 п.о., 179 п.о., 123 п.о.,79 п.о.
рвПЦР (SYBR GREEN I) с указанием уравнений и коэффициентов аппроксимации. КоличествоДНКуз гистона Н1.3: 2,5 нг; 250 пг; 25 пг; 250 фг; 50 фг; 25 фг; 5 фг; 0 фг.Таблица 7. Результаты рвПЦР (SYBR GREEN I) по программе 2, размер ампликона 425 п.о., по программе3, размер ампликонов 179 п.о., 123 п.о., 79 п.о.Размерампликона,п.о.42517912379УравнениеЭффективностьреакцииY= -3,3722x+37,339R2=0,9921Y= -3,1297x+40,604R2=0,9903Y= -3,1721x+45,494R2=0,9583Y= -3,7955x+49,152R2=0,9679Е = 10˄ (-1/-3,3722) =1,98Е = 10˄ (-1/-3,1297) =2,09Е = 10˄ (-1/-3,1721) =2,07Е = 10˄ (-1/-3,7955) =1,83концентрацияДНК гистона Н1.3УЗИ,Log10(50 фг)Расчетное числоциклов1,69897000431,51,69897000435,31,69897000440,11,69897000442,7Согласно уравнениям калибровочных кривых, значения эффективности реакции вслучае ампликонов 179 п.о., 123 п.о., 79 п.о.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
