Диссертация (1091787), страница 23
Текст из файла (страница 23)
(рис 56В). Количествоостаточной ДНК в субстанции инсулина (серия 191112) составило 0,05 ppm (показательС(t)=25), в случае гистона Н1.3 (серия 180912), это значение было 0,1 ppb (показательС(t)=34), что соответствует вышеуказанным нормам.Было проведено сравнение результатов рвПЦР (SYBR GREEN I) при использованииразработанных праймеров к 16S РНК E.coli и праймеров из набора Cygnus. Представленыданные на примере ДНКуз гистона Н1.3, размер ампликона для праймеров к 16S РНКE.coli 425 п.о. При этом были полностью соблюдены рекомендации набора Cygnus вотношении количества праймеров и температурного режима реакции.107Рисунок 57.
A), В) – Кривые плавления для продуктов амплификации праймеров к 16S и праймеров Cygnusсоответственно рвПЦР (SYBR GREEN I); С) Калибровочные кривые для результатов амплификацииразработанных праймеров к 16S и праймеров Cygnus соответственно. Количество ДНКт: 25 нг; 2,5 нг; 250пг; 25 пг; 250 фг; 50 фг; 25 фг; 5 фг; 0 фг. D) Электрофореграмма в 2,5% агарозном геле продуктов рвПЦР: 1– вода; 2,3 - ДНКт гистона Н1.3 2,5 пг/в реакции + праймеры к ампликону 425 п.о.; 4,5,6,7 – ДНКт гистонаН1.3 2,5 пг/в реакции + праймеры Cygnus.Рассчитали эффективность реакции для обоих пар праймеров, эта величина составила2,06 в случае 16S праймеров и 1,79 в случае праймеров Cygnus. Димеров праймеров дляреакции с 16S праймерами не было выявлено (рис. 57А), в отличие от кривых плавлениядля праймеров из набора Cygnus (рис.
57В), где виден пик в области 60-65 °С,соответствующий димерам праймеров. Это говорит о неоптимальности условий реакции,об этом также свидетельствует разброс температур плавления продуктов ПЦР (рис. 57В).Предел чувствительности метода с праймерами Cygnus и ДНКуз штамма-продуцентагистона Н1.3 в качестве положительного контроля составил 25 пг в реакции.Разработанные праймеры для штамма продуцента гистона Н1.3 более чем в 30 разчувствительнее праймеров коммерческого набора. В случае Электрофорез в 2,5 %агарозном геле в присутствии SYBR GREEN I позволил оценить размер ампликонов дляпродуктов реакции (рис. 57С,D).
Для инсулина разработанные праймеры к геномной ДНКштамма-продуцента также показали наибольшую чувствительность (29 раз), посравнению с праймерами из коммерческого набора. Количество остаточной ДНК в АФСинсулина (серия 191112) составило 1,46 ppm, в случае АФС гистона Н1.3 (серия 180912)108это значение было 3,1 ppb, что значительно превышает соответствующие значения,установленные набором Cygnus. Для ампликона размером 100 п.о. получили аналогичныеданные (чувствительность разработанного метода в 29,5 раз больше для ДНКуз гистонаН1.3, для ДНКуз инсулина в 28,8 раз больше чувствительности праймеров набора Cygnus).Таким образом, рассматриваемый коммерческий набор не подходит для определенияминимальных количеств ДНК в субстанции.
Его целесообразно применять лишь наначальных этапах разработки методики ПЦР. При этом разработанный метод дешевлеприменяемого коммерческого набора. Данная цифра складывалась из стоимостиреактивов и коммерческого набора для анализа одной серии исследуемой АФС.4. Сравнение валидационных характеристик метода ИФА дляопределения проинсулина в генно-инженерной субстанции инсулина наоснове набора для плазмы крови, с соответствующими параметрамидругого набора, предназначенного для оценки содержания проинсулина всубстанции инсулина.Одним из важных параметров контроля качества конечного продукта при производствеактивной фармацевтической субстанции генно-инженерного инсулина человека являетсяколичественное определение проинсулин-подобных иммунореактивных белков.
Согласнотребованиям руководств ЕФ, FDA, ICH и WHO, а также согласно ФСП Р N002254/01081209. Содержание этих примесей не должно превышать 10 нг в 1 мг субстанцииинсулина. Для контроля этого параметра в контрольно-аналитической лабораторииОпытногобиотехнологическогопроизводстваИБХРАНиспользовалсяметодтвердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением коммерческих наборов«ПанкреоИФА-проинсулин»(ЗАО«АлкорБио»,Россия),предназначенногодляопределения проинсулина в субстанции генно-инженерного инсулина человека, и набора«Proinsulin ELISA» (DRG InstrumentGmbH, Германия), рекомендуемого для определенияпроинсулина в сыворотке и плазме.
Набор «Proinsulin ELISA» используется в контрольноаналитической лаборатории ИБХ РАН уже на протяжении 5 лет. За это времяпроанализировано более 60 промышленных серий субстанции инсулина, в которыхсреднее содержание проинсулин-подобных белков составляет 0,1-1,0 нг проинсулина на 1мг инсулина. Стоимость анализируемых наборов приблизительно одинакова.109Таблица 12. Сравнение основных характеристик коммерческих наборов «Proinsulin ELISA» и«ПанкреоИФА-проинсулин».Название набора«Proinsulin ELISA»«ПанкреоИФАпроинсулин».НазначениеКоличественное определениепроинсулина в сыворотке иплазме крови человекаТип антител (АТ)Сайт связывания спервичными АТДиапазон измеренийНабор стандартныхрастворов дляпостроениякалибровочной кривойСпособ регистрациирезультатовМоноклональные АТУчасток 56-66 аминокислотныхостатков проинсулина0,024 – 0,6 нг/мл0; 0,024; 0,062; 0,16; 0,31 и 0,62нг/млКоличественное определениепроинсулина в генноинженерном инсулинечеловекаМоноклональные АТНе указан0,5 – 10 нг/мл0; 0,5; 1; 2; 5 и 10 нг/млФотометрический, λ 240нмОкрашивание наблюдается в результате реакции расщепленияH2O2 пероксидазой хрена (HRP) в присутствии субстрата(3,3’,5,5’- тетраметилбензидина)Аналитические характеристикиСпецифичностьНе обнаружено перекрестнойНе обнаруженореакции с инсулином человекаперекрестной реакции(17нмоль/л), проинсулином свиньи с инсулинами человека,(2,5 мкг/мл),свиньи, крупного рогатогопроинсулином КРС ( 2 мкг/мл),скота (КРС),проинсулином крысы (160пмол/л), с проинсулином свиньи ипроинсулином соматомедин-С (10 КРС, С-пептидом человекамкг/мл),соматомедин- С (1 мкг/мл),С-пептидом человека(33нмол/л)Чувствительность0,0047 нг/мл (0,5пмоль/л)Не более 0,3 нг/млРассчитано как сумма значения иСпособ расчета не указанудвоенного стандартногоотклонения «холостой» пробыВоспроизводимостьКоэффициент вариацииКоэффициент вариациимежду повторностями (intra) 2,9не более 8%7,4%между образцами(inter)5,5-6,8%ТочностьВо всем диапазоне 93-101%С использованием(«раскрываемость»)стандарта 2нг/мл 90-110%ЛинейностьВо всем диапазонеВо всем диапазоне(«раскрываемость» при 100,3-106,5%90-110%разбавлении)110ПринципдействиянаборовоснованнаметодеELISA(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay) с использованием двух видов антител – иммобилизованного наповерхности лунок иммуносорбента и коньюгированного с ферментом (пероксидазойхрена) иммунореактанта («сэндвич»-метод).Возможность использования набора «Proinsulin ELISA» для количественногоопределения проинсулина в субстанции генно-инженерного инсулина была доказанапутем оценки ряда валидационных параметров на соответствие критериям приемлемости.Поскольку ИФА – сложный биохимический метод, регистрируемый сигнал которогоявляется результатом взаимодействия многокомпонентной, каскадной схемы, объемпроведения валидационных исследований, а также критерии приемлемости дляопределяемых параметров определены на основе ICH «Guidance for Industry: BioanalyticalMethod Validation», а также EMA «Guideline on bioanalytical method validation».Для получения калибровочных кривых проведено 6 параллельных определений длякаждого из стандартных растворов, рассчитаны средние значения оптической плотности(OD), значения внутисерийного (Sотн, % Intra) и межсерийного (Sотн, % Inter)относительного стандартного отклонения.
Количество испытаний при определении Sотн, %Inter составило n=30 для набора «ПанкреоИФА-проинсулин» и n=60 для набора«ProinsulinELISA».Калибровочныекривыеприведенынарисунке58.Данныедля4-параметрической регрессии были получены на основе пакета программ «CurveExpert1.3.0.». Приведенные результаты показывают, что калибровочный график для набора«Proinsulin ELISA» может быть описан как при помощи уравнения 4-параметрическойрегрессии так и линейного уравнения с высокими коэффициентами аппроксимации.Результаты «обратного пересчета» также соответствуют рекомендациям вышеуказанныхруководств и незначительно различаются между собой (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
