Диссертация (1091787), страница 24
Текст из файла (страница 24)
13)Рисунок 58. А) Калибровочный график для набора «ПанкреоИФА-проинсулин»; В) Калибровочный графикдля набора «Proinsulin ELISA». Данные получены на основе пакета программ «CurveExpert 1.3.0.».При работе с набором «ПанкреоИФА-проинсулин» использование уравнения 4параметрическойрегрессиипозволяетполучить111существенноболеевысокиекоэффициенты аппроксимации и выполнить рекомендации руководства.
Значенияполученных концентраций должны составлять 85-115% от исходных.Таблица 13. Характеристики калибровочных кривых для наборов «ПанкреоИФА-проинсулин» и «ProinsulinELISA».Уравнения для калибровочной кривойлинейное4р регрессияS отн, %НаборСстанднг/млIntran=6Inter«ПанкреоИФА- 07,19,7проинсулин»0,55,57,3133,31,03,54,591,42,06,37,1130,3100,45,04,72,1126,599,910,03,64,292,6100,0«Proinsulin02,16,8ELISA»0,02450,06230,15570,31130,62263,65,4117,79,83,989,592,83,28,297,7100,49,19,899,6100,59,39,3100,399,9видR^Y=0,3323х+0,36790,9568Y=1,7007х+0,1458ОП,%0,9996видR^Y=(0,19*8,58+ 0,99964+4,53*x1,41) /1,41/(8,58+x )Y=(0,16*4,45+ 0,99995+9,15*x1,12)/1,12/(4,45+x )ОП,%65,9103,7115,1Представленные в таблице 14 результаты определения пределов обнаружения (DL) иколичественного определения (QL) указывают на то, что значения, рассчитанные припомощи линейного уравнения, существенно выше заявленных производителями, а способрасчета, рекомендованный производителями набора «Proinsulin ELISA», приводит крезультатам, близким к заявленным, для обоих наборов.Таблица 14.
Значение предела обнаружения и нижнего предела количественного определения для наборов«Proinsulin ELISA» и «ПанкреоИФА-проинсулин».наборПредел обнаружения, нг/млзаявленоПанкреоИФАпроинсулинProinsulinELISA0,005DLl=3,3*S0/bDL=x+2S00,1760,1290,0100,005Нижний предел количественного определения,нг/млзаявленоQLl=10*S0/bQL=3* DL0,300,530,390,030,015Правильность может быть выражена как разность между средним и истиннымзначением с учетом доверительных интервалов или в процентах найденного значения отвведенного количества.Определения проводили для двух параллельных проб в двух повторностях.
Результатысоответствовали критериям приемлемости: средние значения концентрации, близких кверхнему и нижнему пределу количественного определения, находились в диапазоне±25% от номинальных, на остальных уровнях концентрации - в диапазоне ±20% от112номинального значения. Значения внутрисерийного и межсерийного относительногостандартного отклонения не превышали 20% при концентрациях проинсулина, близких книжнему пределу количественного определения, и 15% в остальных случаях.Специфичность метода считается приемлемой, если величина отклика сигналаматрицы,несодержащейаналита,непревышает20%отнижнегопределаколичественного определения, либо если при добавлении аналита (внутреннего стандарта)полученный отклик отличается от сигнала стандартного раствора не более чем на 5 %.При определении количества проинсулина в субстанции инсулина эти «прямые» методыоценки специфичности непригодны, так как невозможно получить свободную от аналитаматрицу (субстанция инсулина всегда содержит проинсулин).В подобных случаях вывод о приемлемости специфичности метода делается порезультатам оценки правильности, полученными с использованием «внутреннегостандарта».Критериемприемлемостисчитаетсяразличиемеждуколичествомпроинсулина, введенного в образец и полученного в результате измерений, не более 20%во всем диапазоне и не более 25% в области верхнего и нижнего предела обнаружений.С целью определения интервала концентраций инсулина, в котором будут выполнятьсятребования к правильности, были приготовлены серии растворов, содержащих одинаковоеколичество проинсулина из контрольной пробы и такие количества испытуемойсубстанции, чтобы общее содержание проинсулина по возможности соответствоваловсему диапазону калибровочного графика.
При испытаниях субстанции с высокимсодержанием проинсулина с помощью набора «ПанкреоИФА-проинсулин» требования кправильности выполняются во всем диапазоне концентраций при соответствующихзагрузках инсулина, рекомендованных производителем (от 0,5 нг до 3,3 нг в лунке). Прииспытаниях субстанции с низким содержанием проинсулина требования к правильностиформальновыполняютсяпризагрузкахинсулина,в4разапревышающихрекомендованные производителем, но при этом количество содержащегося в субстанциипроинсулина близко к нижнему пределу количественного определения. При дальнейшемувеличении загрузки оптическая плотность анализируемого раствора продолжаетснижаться (рис. 59).113Рисунок 59.
Графическое отображение зависимости определяемой концентрации проинсулина отколичества внесенного инсулина А) для набора «ПанкреоИФА-проинсулин»; В) для набора «ProinsulinELISA» (субстанция содержит 0,2 нг проинсулина в 1 мг инсулина).При испытаниях субстанции с высоким содержанием проинсулина при помощи набора«Proinsulin ELISA» требования к правильности выполняются при всех загрузках инсулина,соответствующих диапазону определения, а при определенной загрузке инсулина - вовсем диапазоне концентраций проинсулина.Таким образом, результаты оценки правильности с использованием внутреннегостандартапозволяютпроинсулинавсчитатьсубстанцииспецифичностьинсулинаприметодапомощиопределениянаборасодержания«ProinsulinELISA»удовлетворительной при загрузках инсулина не более 0,16 мг в лунке.
Результаты оценкиправильности представлены в таблицах 15 и 16.Линейность при разведении. При разбавлении субстанции 06-160409 с содержаниемпроинсулина8,7нг/мг,прииспользованиинабора«ПанкреоИФА-проинсулин»,полученные результаты соответствовали требованиям производителя, внутрисерийное имежсерийное относительное стандартное отклонение не превышало 10 % (при заявленных8%). Данные, полученные при разбавлении субстанций 01-150109 и 06-160409 припомощи набора «Proinsulin ELISA» показали, что различие ожидаемых и полученныхрезультатовнаходилосьвинтервале90-110%,внутрисерийноеотносительное стандартное отклонение не превышало 10% (табл. 17).114имежсерийноеТаблица 15.
Результаты оценки правильности при возрастающей загрузке инсулина.КоличествоОбразецНабор06-160409нг в лункеинсулина,мкг в лунке01-150109Количество проинсулина,Правильность,Sотн,%%введенное расчетное полученное«ПанкреоИФА- 00,2500,2500,262104,89,2проинсулин»0,060,2500,2620,24593,58,40,090,2500,2680,24390,75,10,150,2500,2800,24085,711,80,230,2500,2960,22475,614,70,460,2500,3420,22967,08,50,920,2500,4340,19344,513,62,300,2500,7100,17124,114,34,600,2501,1700,15312,87,96,900,2501,6300,1468,612,29,200,2502,0900,1406,714,4«Proinsulin00,01560,01560,012077,113,0ELISA»0,010,01560,01760,015588,211,90,040,01560,02360,018980,28,40,080,01560,03160,025380,112,50,160,01560,04760,0558117,311,30,240,01560,06360,0851133,910,00,320,01560,07960,009211,69,9«ПанкреоИФА- 00,2500,2500,21786,8проинсулин»0,030,2500,5110,556108,80,060,2500,7720,68889,10,090,2501,0330,92189,20,120,2501,02941,07382,90,150,2501,5551,25480,6«Proinsulin00,01560,01560,012077,114,6ELISA»0,0010,01560,02430,0296122,012,80,0020,01560,03300,0385116,811,50,0040,01560,05040,0612121,56,30,0060,01560,08780,063093,08,7115Таблица 16.
Результаты оценки правильности при постоянной загрузке инсулина.Образец01-15010906-160409НаборКоличество проинсулина, нг в лункевведенноерасчетноеПравильность,Sотн,%%полученноеПанкреоИФА-00,12проинсулин0,50,620,5893,66,21,01,121,23109,25,15,05,125,48107,07,2Proinsulin00,00930,007580,69,6ELISA0,00310,01240,011391,08,10,01560,02490,022389,74,70,03110,04040,038695,57,30,04670,05600,053194,86,5ПанкреоИФА-05,22проинсулин0,55,725,94103,84,81,06,226,79109,27,75,010,229,4392,32,9Proinsulin00,02020,016983,610,2ELISA0,00310,02330,022295,47,90,01560,03580,0379105,92,40,03110,05140,045187,816,70,04670,06690,064295,98,45,8Таблица 17.
Результаты оценки линейности при разведении субстанций инсулина (значения содержанияпроинсулина получены при помощи набора «Proinsulin ELISA»).Образец01-15010906-160409Количествоинсулина,мкг в лунке0,160,120,080,040,020,010,01000,00750,00500,00250,00120,00060,0003Количество проинсулина,нг в лункерасчетноеполученноеСоотношение, %0,0320,0240,0160,0080,0040,0020,08700,06520,04350,02170,01090,00550,00280,02900,02230,01490,00730,00430,00170,09360,07120,04220,01990,00980,00510,003090,692,993,191,2107,585,0107,6109,197,091,590,193,0107,8Intra,n=45,49,78,64,37,26,56,47,68,84,23,75,29,5Sотн,%Inter,n=29,89,12,98,77,98,02,87,36,45,96,17,69,4На основании полученных результатов было предложено при анализе субстанцийинсулина готовить серии двукратных разведений в интервале концентраций 1,5-0,01мг/мл(с учетом рекомендуемого производителем объема аликвоты 100 мкл).116Использование набора «ПанкреоИФА-проинсулин» невозможно при содержанииинсулина, более чем в 3 раза превышающее рекомендованное производителем, что непозволяет анализировать субстанции инсулина с содержанием проинсулина менее 1 нг/мг.117V.
ВЫВОДЫ1) Разработан метод рвПЦР для определения остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli,на примере промышленных серий АФС генно-инженерного инсулина человеческого игенно-инженерного гистона Н1.3 человеческого.2) Показана одинаковая чувствительность метода рвПЦР при использовании SYBRGREEN I и технологии TaqMan. Сделан выбор в пользу методики рвПЦР сиспользованием SYBR GREEN I, по причине ее простоты для рутинных исследований.Метод рвПЦР при использовании SYBR GREEN I дешевле методики рвПЦР сприменением технологии TaqMan.3) Установлено, что методика рвПЦР с использованием SYBR GREEN I имеетчувствительность в 30 раз больше коммерческого набора по определению остаточнойДНК E.coli в АФС фирмы Cygnus Technologies.
При этом использование разработанногометодазначительноснижаетстоимостьанализа.Темсамым,подтвержденанеобходимость разработки праймеров, используемых в методе рвПЦР, для конкретныхпромышленных рекомбинантных штаммов в рамках определенного фармацевтическогопроизводства.4) Проведено сравнение валидационных характеристик наборов «Proinsulin ELISA» и«ПанкреоИФА-проинсулин» для определения проинсулина методом твердофазного ИФА.Показана возможность получения достоверных результатов при определении содержанияпроинсулина в АФС инсулина методом твердофазного ИФА с использованием набора«Proinsulin ELISA», предназначенного для определения проинсулина в плазме крови.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
