Диссертация (1091787), страница 21
Текст из файла (страница 21)
и имели максимум при 83,5°С.Расчетное количество остаточной ДНК для АФС инсулина гларгин C(t) = 27 цикла – 0,14пг ДНК / 10 мкг белка (0,014 ppm), для ГЛФ инсулина гларгин 34 циклов – 0,001 пг ДНК /10 мкг белка (0,0001 ppm). Эти значения соответствует нормативным требованиям.Рисунок 46. рвПЦР (SYBR GREEN I) А) Графики накопления ДНКуз для ампликона 425 п.о., программа 2;1– 70 пг ДНКуз, выделенной из биомассы инсулина гларгин после ферментации; 2 – остаточная ДНК,выделенная из АФС инсулина гларгин (количество белка 10 мкг в реакции);3 - остаточная ДНК, выделеннаяиз ГЛФ инсулина гларгин (количество белка 10 мкг в реакции) В) Кривые плавления продуктовамплификации.Анализ последовательности второго продукта (максимум пика на кривой плавленияпродуктов рвПЦР 79 ºС) в АФС при помощи базы данных BLAST выявил 75-80%совпадение обнаруженной последовательности с геном 16S РНК ряда микроорганизмов:Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Lactobacillus casei,Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Staphylococcus epidermidis, Rhodobacter sphaeroides,которые периодически присутствуют в воздухе на поверхности рабочей зоны на этапахочистки рекомбинантного белка.
Это подтверждают данные анализа микробиологическойчистоты воздуха рабочей зоны аспирационным и седиментационным методами. Такимобразом, праймеры к ампликону 425 п.о. предоставляют дополнительную информацию одопустимой микробной контаминации рабочей зоны, но не дают корректного сравненияиспытуемой пробы с контролем. Что требует дальнейшей разработки метода рвПЦР.Стерильная фильтрация на стадии приготовления ГЛФ устраняет допустимую микробную96контаминацию АФС, что подтверждает отсутствие пика неспецифического продукта вГЛФ (табл. 10).1.3.2.
рвПЦР с использованием технологии TaqMan.Поскольку интеркалирующий краситель SYBR Green I связывается с любымидвухцепочечными ДНК, в том числе и димерами праймеров, с целью преодолениянедостатков оптимизируемой реакции и для повышения чувствительности системырвПЦР было предложено использование метода со специфической системой детекции(TaqMan). Основными преимуществами метода TaqMan, относительно SYBR GREENявляется возможность проведения нескольких реакций в одной смеси (напримеродновременное определение содержания плазмидной и геномной ДНК штаммапродуцента в АФС), меньший риск контаминации, большая точность при малыхколичествах субстрата.
Были разработаны линейно-разрушаемые пробы, которые вводилив реакцию с исследуемыми праймерами к геномной ДНК штамма-продуцента. При этомприменяли пакет программ Vector NTI Advance 11.0. В качестве флуоресцентныхкрасителей использовали FAM (карбоксифлуоресцеин); R6G (6-карбоксиродамин). Рольгасителей флуоресценции выполняли BHQ1, BHQ2 (black hole quenchers), RTQ1 (RealTime Quencher - Синтол, Россия). При разработке зонда RealTime(4) 5' FAM- CTA ATACCG CAT(BHQ1) AAC GTC GCA AGA - 3' гаситель флуоресценции поместили в центрмолекулы ДНК для его большего сближения с флуоресцентным красителем и, тем самым,обеспечения лучшего гашения и снижения фоновой флуоресценции рвПЦР. Проводиласьоптимизация рвПЦР по следующим параметрам: концентрация праймеров и TaqManзондов, температура и время и отжига. Оптимальная концентрация праймеров составила10 пмоль в реакции (0,4 мкМ), TaqMan зондов 3,75 пмоль в реакции (0,15 мкМ).Наибольшую чувствительность система имела при использовании флуоресцентныхзондов 16S-RealTime(5) 5' FAM - ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA CCA AAG- BHQ1 3'; 16S-RealTime(1) 5' R6G- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA – BHQ2 - 3'и 16SRealTime(3) 5' FAM- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA – BHQ1 - 3' (рис.
47).97Рисунок 47. рвПЦР (TaqMan). Графики накопления 50 фг ДНКуз гистона Н1.3 для ампликона 179 п.о.,программа 3; 1 – зонд 16S-RealTime(5) 5' - FAM - ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA CCA AAG- BHQ1 3'; 2 – зонд 16S-RealTime(1) 5' - R6G- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA – BHQ2 - 3'; 3 – зонд 16SRealTime(3) 5' - FAM- CTA ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA – BHQ1 - 3'.При этом данные количественного определения остаточной ДНК в АФС инсулина игистона Н1.3, определяемые рвПЦР TaqMan были сопоставимы с данными на основервПЦР с использованием SYBR GREEN I.
рвПЦР для ДНКуз гистона Н1.3 сиспользованием TaqMan зондов при размере ампликона 179 п.о. демонстрирует значениепорогового цикла флуоресценции 34 цикла (зонд 16S-RealTime(5)) при положительномконтроле 50 фг ДНКуз гистона Н1.3. Для рвПЦР с SYBR GREEN I значение указанноговыше параметра составляет 35,3 цикла.1.4. Определение диапазона фрагментов остаточной ДНК в субстанциигенно-инженерного инсулина человеческого при помощи фосфора Р32.На следующем этапе выявили, в каком виде остаточная ДНК штамма-продуцентаE.coli представлена в АФС после прохождения продуктом всех стадий технологическогопроцесса. Анализ меченой фосфором Р32 ДНК, выделенной из 1 мг АФС инсулина, в 12 %ПААГ показал, что 80-90% ДНК имеет размер 80-250 п.о.
(рис. 48). И это ожидаемыйрезультат, поскольку в процессе получения биофармацевтических продуктов основноевоздействие на структуру ДНК клетки-хозяина могут оказывать процессы разрушенияклеток обработкой ультразвуком или давлением, а так же последующая фрагментацияудаление ДНК с использованием ДНКазы. ДНКуз имеет диапазон длин фрагментов от 80до 600 п.о., ДНК, меченая32Р и обработанная ДНКазой - ДНКф от 80 до 150 п.о.
имеетразмер 50-150 п.о.9880-250п.о.300 п.о.200 п.о.100 п.о.1 2 3Рисунок 48. Электрофорез в 12% ПААГ тотальной ДНК штамма-продуцента инсулина, меченной 32P:1 – тотальная ДНК штамма-продуцента инсулина, обработанная ДНКазой (ДНКф); 2 - тотальная ДНКштамма-продуцента инсулина, обработанная ультразвуком (ДНКуз); 3 - остаточная ДНК штаммапродуцента инсулина, выделенная из субстанции инсулина (ДНКс).Вследствие низкомолекулярного диапазона фрагментов остаточной ДНК в АФСинсулина, для дальнейших исследований сделали выбор в пользу ампликонов размером от80 до 250 п.о.1.5.
Оценка содержания остаточной ДНК в АФС генно-инженерногоинсулиначеловеческогоигенно-инженерногогистонаН1.3человеческого при помощи праймеров к ампликонам размером 100 п.о. и198 п.о.Были разработаны праймеры к фрагменту гена 16S РНК E.coli, с размером ампликонов100 и 198 п.о. Температуры отжига для прямого и обратного праймеров каждогоампликона абсолютно идентичны, что дополнительно повышает эффективность рвПЦР.Небольшой размер праймеров позволяет проводить идентификацию в низкомолекулярномдиапазоне фрагментов остаточной ДНК E.coli.
На первом этапе провели ПЦР в диапазонетемператур отжига от 50°С до 70°С (рис. 49), затем результаты визуализировали припомощи электрофореза в 1,5 % агарозном геле. Это позволило выбрать оптимальныетемпературы отжига для каждой пары праймеров.99Рисунок 49. Электрофореграмма в 1,5% агарозном геле продуктов амплификации фрагмента 198 п.о. вприсутствии SYBR GREEN I.
Количество ДНКуз в реакции 100 пг. Программа 1 с диапазоном температуротжига от 50°С до 70°С; 33 цикла; 1 – вода; температуры отжига праймеров: 2 - 50°С; 3 - 51,4°С; 4 - 53,8°С;5 - 57,5°С; 6 - 62,0°С; 7 - 65,9°С; 8 - 68,5°С; 9 - 70°С. 10 -– маркер молекулярных весов.Согласноданнымгоризонтальногоэлектрофорезадлядвухрассматриваемыхампликонов оптимальная температура отжига праймеров составила 58ºС при времениотжига 40 сек.
По результатам рвПЦР (SYBR GREEN I) по оптимизированной программеампликон 100 п.о. показал большую чувствительность, в сравнении с ампликоном 198 п.о.(рис. 50). Значение порогового цикла флуоресценции для 50 фг ДНКуз гистона Н1.3составило 32 цикла (ампликон размером 100 п.о.), 35 циклов (ампликон размером 198п.о.). Для ранее рассматриваемого ампликона размером 179 п.о. это значение составляло35,3 цикла для 50 фг ДНКуз гистона Н1.3.Рисунок 50. рвПЦР (SYBR GREEN I) А) Графики накопления: ДНКуз гистона Н1.3, положительныйконтроль 50 фг в реакции, программа 3. 1 - праймеры к ампликону 100 п.о., 2 - праймеры к ампликону 198п.о..
В) Кривые плавления продуктов амплификации.Применение метода рвПЦР с TaqMan зондами демонстрировало аналогичныерезультаты. Значение порогового цикла флуоресценции для 50 фг ДНКуз гистона Н1.3составило 33 цикла (ампликон размером 100 п.о.), 35 циклов (ампликон размером 198п.о.). Данные приведены на рисунке 51.100Рисунок 51. Графики накопления продукта в ходе рвПЦР (TaqMan), положительный контроль 50 фг ДНКузгистона Н1.3 для ампликонов размером: 1 - 100 п.о., 2 – 198 п.о., программа 3; зонд 16S-RealTime(5) 5' FAM- ATA CCG CAT AAC GTC GCA AGA CCA AAG- BHQ1 - 3'На рисунке 52 представлены данные рвПЦР (SYBR GREEN I) для разработанныхпраймеров к ампликону размером 100 п.о.
При этом С(t) для ДНКуз инсулина вколичестве 70 пг в реакции составил 18,8, тогда как этот показатель для ДНКуз гистонаН1.3 в количестве 50 фг в реакции составил 32,0 (рис. 52А). Что соответствуетсоответствующим величинам для ампликона 425 п.о. Кривые плавления указывают наотсутствие димеров праймеров (рис. 52В). Данные по содержанию остаточной ДНК вАФС инсулина при использовании праймеров к ампликонам размером 100 п.о. и 179 п.о.представлены в таблице 11.
Пики на кривых плавления АФС и контроля были одинаковыи соответствовали ампликону размером 100 п.о.Рисунок 52. рвПЦР (SYBR GREEN I). А) Графики накопления: ДНКуз инсулина – 70 пг/в реакции (1);ДНКуз гистона Н1.3 – 50 фг в реакции (2), программа 3, праймеры к ампликону 100 п.о. В) Кривыеплавления продуктов амплификации. Тпл 100 п.о. около 81,5°С.101Таблица 11. Содержание остаточной ДНК штамма-продуцента E.coli в АФС инсулинаИсследуемыйобъектСерияРазмер ампликона,п.о.Содержание остаточной ДНК штаммапродуцента E.coli, ppm1001791001796,11,525,91,5061112АФС инсулина091112Для АФС гистона Н1.3 серии 381212 этот показатель составил 4,8 ppb, чтосоответствует количеству остаточной ДНК в ГЛФ препарате Онкогист (праймеры кампликону 425 п.о.).1.6.
Исследование содержания остаточной ДНК штамма-продуцентагистона методом капельной цифровой ПЦР (кцПЦР) на основе TaqManпроб. Сравнение результатов реакции для разработанного икоммерческого TaqMan зондов.Инновационный подход кцПЦР является количественным методом и заключается всоздании эмульсии на основе реакционной смеси и масла, объем реакционной смеси 20мкл. При этом ПЦР реакция идет в каждой отдельной капле, после чего при помощиридера капель считывают информацию в каждой из 20000 капель. В полученном массиведанных виден основной пик, при этом все неспецифические взаимодействия появляются ввиде отдельного массива, либо в виде отдельных точек, при их минимальном количестве.Рассматриваемый метод подходит для определения остаточной ДНК штамма вбиофармацевтических субстанциях на фоне присутствия большого количества белка.
Вреакциииспользовалиреакционнуюсмесь,специальноразработаннуюфирмой-производителем прибора для эмульсионой ПЦР.В цкПЦР вносили АФС гистона, трипсинолизированную АФС гистона, а также ДНКуз- положительный контроль. При этом использовали метод добавок. В реакциииспользовали коммерческие праймеры и флуоресцентные зонды (BIO-RAD, США), атакже разработанные праймеры к фрагменту гена 16S РНК E.coli (размер ампликона 100п.о.) и зонд TaqMan зонд 16S-RealTime(5). Амплификацию проводили по программе 4,финальная стадия 98 °С в течение 10 мин необходима для получения более стабильнойструктурыкапельэмульсии.Валидационныеданные,представленныефирмой-производителем указывают на то, что последняя стадия улучшает качество данных наэтапе чтения данных ридером капель.Прибор не регистрирует значение порогового цикла флоресценции С(t).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
