Диссертация (1091787), страница 14
Текст из файла (страница 14)
В общей смеси при обычном ПЦР при таком сильномразведении эти мутации невозможно обнаружить. Похожая картина нередко наблюдаетсяв отношении минорных опухолевых мутациях. При капельном же ПЦР исследовательстановится независимым от сильного «разведения мутации», поскольку в одной из многихтысяч капель реакционной смеси концентрация мутации резко возрастает по отношению кнормальным молекулам ДНК и далее её концентрация в процессе амплификации растетеще больше [91, 92].60Рисунок 24. Прибор для капельной цифровой ПЦР или кцПЦР (droplet digital PCR - ddPCR QX100,BIO-RAD). Процесс осщуествляется в три этапа: 1 – получение эмульсии в генераторе капель; 2 –проведение ПЦР в амплификаторе; 3 – регистрация сигнала при помощи ридера капель и анализрезультатов.Рассмотренный подход имеет массу преимуществ, в сравнении с рвПЦР, и подходитдля определения остаточной ДНК штамма-продуцента в АФС на фоне большогоколичества белка.
Что на этапе пробоподготовки позволяет исключить стадию выделенияДНК из субстанции. Минусом является тот факт, что пробы после анализа в ридере капельнесохраняются,аперемещаютсявобщийслив.Тоестьдляпроведенияэлектрофоретического разделения продуктов кцПЦР необходимы дополнительныеповторы. Кроме того, положительный момент в том, что результаты измеренийпредставлены в виде численного значения копий в мкл. Что также позволяет вводить вреакцию помимо испытуемой пробы лишь положительный и отрицательный контроли, неприменяя калибровочные растворы.2.9. Метод иммуноферментного анализа.2.9.1.
Основы метода ИФА.Иммуноферментныйанализ(ИФА)являетсяоднимизнаиболееактивноразвивающихся направлений химической энзимологии. Это обусловлено тем, что в ИФАуникальнаяспецифичностьиммунохимического61анализасочетаетсясвысокойчувствительностью детекции ферментативной метки (вплоть до 10 -21 молей в образце).Высокие результаты достигаются благодаря использованию ферментов-биокатализаторов,которые позволяют создавать каскадные системы усиления различных химическихсигналов.Высокая стабильность реагентов, простота методов регистрации и многие другиедостоинства метода ИФА способствовали его широкому внедрению в различные областимедицины, сельское хозяйство, биологическую промышленность, охрану окружающейсреды, а также в научные исследования. Применение ИФА в различных областях научнойи практической деятельности ставит перед исследователем задачу: освоить основныеприемы, необходимые для самостоятельной разработки метода и его эффективногоиспользования.Теоретические основы ИФА опираются на современную иммунохимию и химическуюэнзимологию, знание физико-химических закономерностей реакции антиген - антитело, атакже на основные принципы аналитической химии.
Разнообразие объектов исследованияот низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкийкруг задач, связанных с многообразием условий применения ИФА, обусловливаютразработку чрезвычайно большого количества вариантов этого метода, в результате чегостановится все труднее и труднее ориентироваться в потоке информации и данном методе.Основанныесоответствующиминаспецифическомантителами,связываниишироковошливопределяемогоаналитическуюсоединенияпрактикуииспользуются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологическойи пищевой промышленности, для целей охраны окружающей среды.Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основнымифакторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антигенантитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностьюметодов его детекции.
В общем виде реакция антиген-антитело может быть описанапростой схемой:[AT]+[АГ]↔[АТАГ]Иммунохимическая реакция в растворе между антителами и антигенами протекает внесколько стадий, первой из которых является обратимое образование комплекса состава1:1. Образование специфического комплекса антиген - антитело обеспечиваетсягидрофобными, ионными и вандер-ваальсовыми взаимодействиями, а также водороднымисвязями. Вследствие наличия в молекуле антител более одного центра связывания дляполивалентных антигенов возможно дальнейшее многостадийное образование сложныхкомплексов с различным соотношением в нем компонентов [93].62Рисунок 25.
TECAN Infinite 200 Pro спектрофотометр для измерения концентрации белка, используетсядля ИФА, оборудован планшетом nanoquant для измерения концентрации ДНК при объеме пробы 2 мкл.2.9.2. Индикация комплекса антиген-антитело.Индикация образовавшегося комплекса антиген - антитело может быть осуществлена,если в один из исходных компонентов реакционной системы ввести метку, которая легкодетектируется соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом.Весьма удобными для этой цели оказались ферментные, флуоресцентные, изотопные,парамагнитныеметки,использованиекоторыхдаловозможностьувеличитьчувствительность иммунохимических методов во множество раз, а время анализауменьшить до нескольких часов.Для осуществления высокой специфичности, чувствительности, воспроизводимостианализа необходимо провести эффективное разделение комплексов от свободныхкомпонентов.
Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов парыантиген—антителопрочноиммобилизовать(связать)натвердомносителе.Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическоеразделение образующихся иммунных комплексов от свободных компонентов. МетодELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) это твердофазный иимуноферментныйанализ, использующий меченный ферментом иммунореактант, а также иммуносорбент,связанный с твердым носителем [94]. Возможность прочного связывания на носителеантител или антигенов с сохранением их способности к специфическому образованиюиммунных комплексов и разработка на этом принципе твердофазных методов далимощный импульс для развития новых подходов в иммунохимических методах анализа.Использование твердых носителей для сорбционной или ковалентной иммобилизацииантител с последующим специфическим связыванием анализируемого соединения наиммуносорбенте и выявлением образовавшихся иммунокомплексов с помощью меченныхферментами компонентов положило начало методам твердофазного (гетерогенного)иммуноферментного анализа [95,96].632.9.2.1.
Ферменты в качестве меток в иммуноанализе.Принципиальная возможность применения ферментов в качестве меток в ИФАобусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе.К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований. Основнымиявляются следующие: высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента, позволяющаяобнаруживать ферментативную метку в низких концентрациях; доступность ферментов; возможность получения достаточно чистых ферментныхпрепаратов, сохраняющих высокую ферментативную активность после химическоймодификации при получении конъюгата с антителами или антигенами; стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом; простота и чувствительность метода определения концентрации фермента.НаибольшеераспространениевгетерогенномИФАсредиферментов,удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидаза хрена (КФ1.11.1.7), щелочная фосфатаза (КФ 3.1.3.1) и β-D-галактозидаза (КФ 3.2.1.23).Пероксидаза хрена (англ.
Horseradish peroxidase, HRP) представляет собой глобулярныйбелок с молекулярной массой 40 кДа, относится к классу оксидоредуктаз. Ферменткатализирует двухсубстратные реакции с участием перекиси водорода (реже органическихгидроперекисей). На первой стадии взаимодействие фермента Е с перекисью приводит кобразованию промежуточной окисленной формы EI. На второй стадии происходитодноэлектронное восстановление EI вторым субстратом АН2, являющимся доноромводорода, с образованием второй промежуточной формы фермента Е II, которая послевзаимодействия со второй молекулой донора переходит в нативный фермент:E + H2O2EIEI + АН2ЕII + - AHEII + АН2Е + - AH2 (- AH)A + АН2Фермент обладает широкой специфичностью по второму субстрату и способенокислять замещенные фенолы, анилины, о-фенилендиамины, о-дианизидин, люминол, ламинобензойную кислоту и целый ряд других органических и неорганическихсоединений.Коммерческидоступныесубстратыпероксидазыхрена3,3’,5,5’-Тетраметилбензидин (англ.
TMB) и 3,3'-Диаминобензидин (англ. DAB) при окислениидают цветные продукты, а хемилюминесцентные вещества SuperSignal, ECL (enhanced64chemiluminescence)являютсяисточникамидетектируемогосветапридействиипероксидазы хрена [97].2.9.2.2. Получение конъюгатов для иммуноферментного анализа.Разработка высокочувствительных и специфических методов ИФА связана снеобходимостью получения конъюгатов, обладающих определенными характеристиками.В этой связи можно сформулировать основные требования, которым должныудовлетворять методы синтеза различного рода конъюгатов: должны сохраняться ферментативные, иммунологические или антигенные свойства конъюгата; конъюгатдолженлегковыделятьсяизреакционнойсмесиприиспользованиисоответствующих методов очистки; выход конъюгата должен быть достаточно высоким; конъюгат должен быть определенного состава; полученный конъюгат должен быть стабильным при хранении.Получение конъюгатов фермент - белок.Для высокочувствительных методов ИФА необходимы конъюгаты белок - фермент, вкоторых белок сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивациифермента.
Таким требованиям наилучшим образом отвечает конъюгат белок - ферментсостава 1:1. При увеличении числа молекул фермента существенно уменьшаетсяиммунологическая активность белка, так как при этом возрастают стерическиепрепятствия для протекания иммунной реакции и увеличивается вероятность того, чтоферментокажетсясвязаннымсактивнымцентромантителаилиантигеннойдетерминантой антигена. Из реакционной смеси конъюгаты выделяют диализом илипутем гельфильтрации, а для очистки иногда применяют аффинную хроматографию [93].Конъюгаты получают при помощи трех основных групп методов: биохимических,иммунологических и генно-инженерных.В биохимических методах используется сшивка фермента Е с антителом илиантигеном при участии свободных реакционноспособных групп: —NH2, -СООН, -SH, ОН.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
