Диссертация (1091787), страница 13
Текст из файла (страница 13)
При накоплениисоответствующего пробе продукта реакции, процесс реассоциации пробы начинаетконкурировать с процессом гибридизации олигонуклеотидов на мишень, что ведет кувеличению уровня флуоресценции (рисунок 18) [78]. В случае использованияполимеразыс5'-экзонуклеазнойактивностью,гибридизованныенамишеньолигонуклеотиды будут разрушаться, приводя к еще большему увеличению специфичногосигнала. В качестве преимуществ метода можно назвать легкий синтез и сравнительнонизкую цену проб.
Основной недостаток метода — высокий уровень фоновойфлуоресценции.Рисунок 18. Схема работы «вытесняющей пробы». Флуорофор и гаситель флуоресценции расположены накомплементарных олигонуклеотидax так, что при образовании дуплекса они оказываются сближены.
Вслучае образования специфичного продукта ПЦР часть проб не реассоциирует, а гибридизуется спродуктом реакции, приводя к увеличению уровня флуоресценцииЛинейные разрушаемые пробы (TaqMan). В данном подходе олигонуклеотид,комплементарный продукту ПЦР, метят флуорофором и гасителем флуоресценции(возможно использование как концевого, так и внутреннего мечения олигонуклеотида). Вотсутствие мишени флуорофор и гаситель сближены (обычно олигонуклеотид стремитсяреализовать максимально возможное число водородных связей, что в большинствеслучаев ведет к его «самозашпилеванию», сближая флуорофор и гаситель) ифлуоресценция подавлена (обычно по механизму флуоресцентно-резонансного переносаэнергии). При накоплении совтветствующего продукта реакции, проба гибридизуется наампликон, что ведет к ее разрушению за счет 5'-экзонуклеазной активности Таqполимеразы (рисунок 19) [79, 80].
Интенсивность сигнала возрастает с каждым цикломПЦРпропорциональнонакоплениюампликонов56[79,81].Вданномподходепринципиально использование полимеразы с хорошо выраженной 5'-экзонуклеазнойактивностью.Рисунок 19. Схема работы «разрушаемых проб». Пробы несут флуорофор и гаситель флуоресценции. Покапроба находится в растворе, за счет близкого расположения, гаситель эффективно поглощает энергиюфлуорофора. В случае гибридизации со специфичным продуктом реакции проба разрушается за счет 5'экзонуклеазной активности полимеразы, что ведет к разобщению флуорофора и гасителя и возрастаниюфлуоресценции.Пробы с ИКП («молекулярные маячки», beacons). Вариантом предыдущейтехнологии является использование проб, несущих короткий (5-8 пар нуклеотидов)инвертированный концевой повтор (ИКП).
Флуорофор и гаситель располагают по концамолигонуклеотида. Пробы, находящиеся в растворе, при температурах ниже 55-60°Собразуют структуру типа стебель-петля с очень низким уровнем флуоресценции(поскольку за счет близкого расположения флуорофора и гасителя возможно эффективноеконтактноегашение,см.выше).Пригибридизациисампликономпроба«разворачивается», что ведет к существенному повышению уровня флуоресценции(рисунок 20) [82, 83, 84]. Использование проб со шпилькой, за счет реализацииконтактного гашения, несколько повышает разнообразие флуорофоров, возможных длядетекции в одной пробирке [84].Несмотря на то, что авторы делают упор на отсутствие разрушения проб за счет 5'экзонуклеазной активности фермента, очевидно, что данный акцент необходим восновном для ухода от патента фирмы Рош (Roche, Швейцария) на использованиелинейных разрушаемых проб.
В большинстве публикаций с использованием проб сошпилькой исследователи не утруждают себя покупкой фермента без 5'-экзонуклеазнойактивности, что практически сводит их методику к стандартной технологии разрушаемыхпроб.57Рисунок 20. Схема работы «молекулярных маячков».
Пробы несут короткий инвертированный концевойповтор, по краям которого расположены флуорофор и гаситель флуоресценции. В растворе пробаформирует шпилечную структуру, в которой флуорофор и гаситель сближены. При гибридизации соспецифичным продуктом реакции проба «разворачивается» , что ведет к разобщению флуорофора игасителя (при использовании фермента с 5'-экзонуклеазной активностью проба будет работать так же, как иразрушаемая проба).Неоспоримым является преимуществопробсо шпилькойприрегистрациирезультатов по окончании ПЦР («по конечной точке»). В отличие от детекции накопленияДНК в ходе ПЦР, происходящей при 50-60 °С, когда фоновая флуоресценцияразрушаемых проб и проб со шпилькой сопоставима, измерение флуоресценции «поконечной точке» (при комнатной температуре) делает фоновую флуоресценцию проб сошпилькой существенно меньше таковой для линейных разрушаемых проб.Примыкающие пробы.
В данной методике используют два олигонуклеотида,гибридизующихся с матричной ДНК в непосредственной близости друг от друга. Один изолигонуклеотидов несет флуорофор-донор, другой — флуорофор-акцептор. Гибридизациядвух олигонуклеотидов с матрицей ведет к сближению флуорофоров и переносу энергии сдонора на акцептор [85] (рисунок 21). Детекцию продуктов амплификации ведут путемрегистрацииспектрафлуорофора-донора.флуоресценцииНаибольшеефлуорофора-акцепторараспространениеданныйприподходвозбуждениинашелприопределении одно-нуклеотидных полиморфизмов [86, 87, 88], позволяя определять сразунесколько вариабельных позиций ДНК в одной пробирке [89].Рисунок 21. Схема работы примыкающих проб.
Система состоит из двух олигонуклеотидов,гибридизующихся на матрицу рядом. Один из олигонуклеотидов несет флуорофор-донор (обозначен58зеленым цветом), другой — флуорофор-акцептор (обозначен красным цветом). Акцептор может эффективнопоглощать энергию, излучаемую донором. При образовании специфичного продукта реакции олигонуклеотиды гибридизуются рядом, что ведет к эффективному переносу энергии с донора на акцептор, а накоплениепродукта регистрируют по увеличению флуоресценции акцептора.2.8.3.4. Оборудование для ПЦР в реальном времени.Среди направлений развития приборной базы для рвПЦР можно выделить повышениепроизводительности оборудования, повышение надежности и возможность интеграциидетектирующего амплификатора в роботизированные пипетируемые станции.
Дляувеличения производительности оборудования большое значение имеют следующиефакторы. Увеличение числа образцов в одной постановке, что достигается увеличением числалунок до 384 или до 1536 при сохранении габаритных размеров планшета; Сокращение времени на проведение ПЦР за счет использования новых материалов итехнологий; Увеличение числа оптических каналов, что позволяет провести ПЦР для большегочисла целей; Использование в составе оборудования роботизированных станций, выполняющихработу по пробоподготовке, внесению образцов и компонентов реакционной смеси. Использование масел для создания эмульсий, позволяющих проводить отдельные ПЦРреакциив каждой капле реакционной смеси.Повысить надежность амплификатора можно за счет исключения из конструкцииприбора элементов, требующих регулярной замены, таких как галогеновые лампы (ихзамена на светодиоды), выгорающих фильтров и т.п.Рисунок 22.
Roche LightCycler 480. Для поточного количественного анализа специфических участков ДНКили РНК возможно применение несколько методов. Одним из наиболее точных, быстрых и выгодныхявляется метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real Time PCR/ПЦР-РВ) в малыхобъемах реакционной смеси в планшетах на 96 - 1536 лунок.
Пять возбуждающих и шесть детекционныхфильтров позволяют Вам самостоятельно выбирать формат Вашего исследования с использованиемразличных зондов и флуоресцентных красителей: SYBR Green I, гидролизные зонды (TaqMan),гибридизационные зонды (HybProbe), зонды SimpleProbe, зонды Molecular Beacons и другие.59Рисунок 23.
FasTrans - роботизированная станция для ПЦР пробоподготовки. Система FasTrans специальноразработана для автоматической подготовки ПЦР планшетов. Поддерживаются 96-, 384- и 1536-луночныеформаты планшетов. Устройство FasTrans предназначено для решения задач раскапывания припробоподготовке небольших и средних объемов образцов.Современныекомпьютерныепрограммывкомбинациисприменениемфлоуресцентно-меченных гибридизационных олигонуклеотидных проб для визуализациирезультатов ПЦР (методы FLASH или ПЦР в «реальном времени») позволяет практическиполностью исключить неверную трактовку результатов.
Автоматизированная системафиксирования данных с детектирующего амплификатора или специализированногофлоуриметра в памяти персонально компьютера позволяет вести эффективнуюдокументацию и хранение информации с возможностью выведения отчета о проведенноманализе в стандартном виде [66].Новым подходом на даный момент времени является добавление в реакционнуюсмесь масел, с целью последующего получения эмульсии и проведения отдельно ПЦРреакции в каждой капле. Капельный цифровой ПЦР (Droplet Digital PCR- ddPCR) –усовершенствованный количественный метод полимеразной цепной реакции (кцПЦР),при котором реакционная смесь после добавления ДНК распыляется на множествомельчайших капель.
Размер одной капли порядка 100 мкм. В реакционной смеси 20 мклсодержится 20000 капель [90]. При этом возможна визуализация результата реакции вкаждой капле. При использовании специального чипа по завершению реакции его можноиспользоватьдляпроведениясеквенированияскаждойкапли.Какимижепреимуществами обладает данный метод? Если рассматривать анализ ДНК, то в клеткемогут встречаться редкие мутации, например лишь в одной из нескольких сотенклеточных митохондриальных ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
