Диссертация (1145685), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Полученный образецинкубировали при +45 °С в течение 3 часов, затем анализировали методами ВЭЖХ или кИЭФ.50Искусственное дезамидирование ИЛ-36РА3.15.Для искусственного дезамидирования к 120 мкл образца ИЛ-36РА с концентрацией 5мг/млв50мМнатрий-фосфатномбуферерН6,0,полученномуврезультатехроматографической очистки и ультрафильтрации, добавляли 480 мкл 100 мМ трис-HCl буферарН 9,1.
Полученный образец инкубировали при +45 °С в течение 18 часов, затем анализировалиметодами ВЭЖХ или кИЭФ.ВЭЖХ анализ чистоты и гомогенности ИЛ-36РА3.16.ВЭЖХ анализ проводился при участии Протасова Е.А., за что автор приносит своюискреннюю благодарность. Участие автора состояло в получении и подготовке образцов дляанализа, постановке задач, подборе методик, интерпретации результатов и их теоретическомобобщении.Все исследования методом ВЭЖХ проводились на хроматографе НР-1050 (HewlettPackard, СШA) с детектором 1290 Infinity II Diode Array Detector FS (Agilent, США),градиентной системой подачи растворов и термостатом для колонки. Полученные результатыобрабатывали в программе Мультихром (Амперсанд, Россия).
В зависимости от целиисследования отличались параметры, изложенные далее.3.16.1.ОФ-ВЭЖХ для определения чистоты ИЛ-36РАДля определения неродственных ИЛ-36РА примесей в получаемых образцах ИЛ-36РАприменяли ОФ-ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила. Использовали колонку Jupiter С18(Phenomenex, США) из нержавеющей стали, длиной 0,25 м и внутренним диаметром 4,6 мм,заполненную силикагелем С18 с диаметром частиц 5 мкм, диаметром пор 300 Ао. 10 мкг ИЛ36РА в 20 мкл раствора наносили на колонку в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,0. Элюциюпроводили градиентом ацетонитрила с 30 до 70% в 0,1% трифторуксусной кислоте (ТФУ), рН2,5, за 20 минут при скорости потока 1,5 мл/мин и температуре +35 °С. Детектированиепроводили при длине волны 220 нм.513.16.2.ОФ-ВЭЖХдляопределенияпримесинепроцессированнойиокисленной форм ИЛ-36РАКоличественный анализ примеси непроцессированной метиониновой формы ИЛ-36РАпроводили при разделении пробы ИЛ-36РА методом ОФ-ВЭЖХ.
Условия анализа былианалогичны вышеописанным, отличие было только в том, что элюцию проводили градиентомацетонитрила с 39,6 до 40,8% в 0,1% ТФУ.3.16.3.ОФ-ВЭЖХ для определения примеси Triton X-114Количественный анализ примеси Triton X-114 в образцах ИЛ-36РА проводили методомОФ-ВЭЖХ на колонке DeltaPak C18 (Waters, США). 10 мкг ИЛ-36РА в 25 мкл растворананосили на колонку в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,0. Элюцию проводили 70%ацетонитрилом в 0,1% ТФУ, рН 2,5, за 5 минут при скорости потока 1 мл/мин и температуре+35 °С. Детектирование проводили при длине волны 220 нм. В качестве стандартного образцадля сравнения использовали 25 мкл 0,001% раствора Triton X-114 в 50 мМ фосфатном буфере,рН 6,0.
Количество Triton X-114 в образцах ИЛ-36РА определяли сравнением площадей пиков,соответствующих Triton X-114, в стандартном и исследуемом образце.3.16.4.ГП-ВЭЖХ для определения агрегатов ИЛ-36РАКоличественный анализ агрегатов в образцах ИЛ-36РА проводили методом ГПХ-ВЭЖХна колонке Superdex 75 10/30 GL (GE, США). Для этого 40 мкл образца ИЛ-36РА сконцентрацией 500 мкг/мл в 50 мМ фосфате натрия рН 6,5 с 0,2 М сульфата аммония.Подвижной фазой служил такой же раствор. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,75мл/мин, время детекции 30 мин, температура колонки +20 °С.
Детектирование проводили придлине волны 220 нм. Время удержания пика неагрегированного ИЛ-36РА составляло около 20мин.3.17.Определение примеси дезамидированной формы ИЛ-36РА с помощьюкапиллярного изоэлектрофокусированияАнализ образов полученного нами ИЛ-36РА методом капиллярного электрофорезапроводился при участии Сергеевой Д.С., за что автор приносит свою искреннююблагодарность.Анализируемый образец обессоливали с помощью ультрафильтрационных спин-колонокAmicon Ultra-0.5 (Merck-Millipore, США). Раствор образца помещали в колонку и52центрифугировали при 14000 g в течение 7 минут. Затем фильтрат удаляли, в колонкудобавляли раствор 20 мМ трис-буфера рН 8,0 до конечного объема 500 мкл и повторялицентрифугирование. Замену буфера проводили дважды.
Для приготовления пробы в пробиркуобъемом 1,5 мл добавляли 100 мкл геля для кИЭФ, содержащего 3 М мочевину, 6 мкламфолитов Pharmalyte 3-10, 10 мкл катодного стабилизатора, 1 мкл анодного стабилизатора, по0,5 мкл каждого пептидного маркера и 5 мкл обессоленного образца субстанции. Пробуперемешивали и центрифугировали при 5000 g в течение 5 минут.Для кИЭФ использовали аппарат Капель 105М (Люмэкс, Россия). Перед введениемпробы капилляр промывали раствором 4,3М мочевины (4 мин, 2000 мбар), затемдеионизованной водой (4 мин, 2000 мбар). Образцы вводили при давлении 2000 мбар в течение2 минут с последующим погружением входного и выходного электрода в воду. Фокусировкапроводили раствором анолита (200 мМ фосфорная кислота) на входном конце и католита (300мМ гидроксид натрия) на выходном конце капилляра при напряжении 25 кВ в течение 20минут.
Затем для химической мобилизации на выходе капилляра устанавливали пробирку схимическим мобилизатором (350 мМ уксусная кислота) и подавали напряжение 25 кВ в течение60 минут, после чего капилляр промывали деионизованной водой (5 мин, 2000 мбар). Во времявсех этапов осуществляли термостатирование капилляра при температуре +20 °С и детекцию надлине волны 280 нм. На полученных во время этапа мобилизации электрофореграммахотмечали пики, соответствующие пептидным маркерам и изоформам исследуемого белка.Интегрирование пиков производили автоматически в программе Эльфоран (Люмэкс, Россия).Расчетизоэлектрическихточекизоформосуществлялипоуравнениюзависимостиизоэлектрических точек пептидных маркеров от времени их миграции, полученному методомлинейной регрессии.3.18.Динамическое светорассеяниеЭксперименты по динамическому светорассеянию в образцах фармацевтическойсубстанции (ФС) ИЛ-36РА проводились на оборудовании лаборатории бионанотехнологии (зав.М.В.
Дубина) ГБОУ «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого(СПбПУ)», автор приносит искреннюю благодарность за предоставленную возможность.Образцы фармацевтической субстанции ИЛ-36РА анализировали на аппарате ZetasizerNano (Malvern Instruments, Великобритания) в кювете Quartz SUPRASIL Precision cell (HellmaAnalytics, Германия).
Объем образца составлял 100 мкл. Анализ проводили по следующей53программе: образец в кювете нагревался сначала до +20 °С, потом с шагом в 5 градусовпоследовательно нагревался до +70 °С. Время уравновешивания температуры образцасоставляло 60 секунд. В каждой точке проводилось измерение светорассеяния, при этомпроводилось 3 последовательных измерения, каждое из которых являлось усреднением 12независимых измерений.3.19.Статистическая обработка результатовКоличественные данные представлены как среднее арифметическое ± стандартноеотклонение (SD). Нормальность распределения определяли тестами Д’Агостино-Пирсона иШапиро-Уилка. Сравнение пар групп проводили с помощью t-теста Стьюдента.
Сравнениемножества групп проводили с помощью теста Даннетта. Различия считали достоверными при р< 0,05. Все анализы проводили с помощью программы Prism 6 (GraphPad Software, США).544. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕВыполненная работа проводилась в рамках проекта лаборатории иммунофармакологииФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» по разработке лекарственного средства на основе рекомбинантногорецепторного антагониста интерлейкина-36 (ИЛ-36РА) человека для лечения псориаза.
Главнаяцельпроведенногоисследованиясостоялавразработкетехнологииполученияфармацевтической субстанции ИЛ-36РА и исследовании биологических и физико-химическихсвойств этого белка.4.1. Получение штамма-продуцента ИЛ-36РА, исследование биологических свойствИЛ-36РА4.1.1.
Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА на основе E.coli BL21[DE3]Поскольку ИЛ-36РА не имеет сайтов гликозилирования и другие цитокины семействаИЛ-1, структурно схожие с ИЛ-36РА, были успешно получены в прокариотических системахэкспрессии, рекомбинантный ИЛ-36РА получали в E. coli.[11].Ранее во ФГУП «ГосНИИ ОЧБ» ФМБА России были получены бактериальные штаммыпродуценты белков ИЛ-36γ и ИЛ-36РА человека, содержащих С-концевые гексагистидиновыепоследовательности, что существенно облегчало процедуру их выделения с помощьюаффинной металл-хелатной хроматографии. Полученные из этих штаммов белки использовалидля изучения физико-химических свойств и анализа биологической активности различныхвариантов белков группы ИЛ-36.
Однако применение в клинической практике рекомбинантныхбелков, содержащих гексагистидиновые метки, часто осложнено их иммуногенностью. В связис этим мы получили новый штамм-продуцент ИЛ-36РА человека, E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf), содержащий плазмиду pET-IL36Raf, несущую последовательность нативногоцитокина под контролем промотора фага Т7, и не несущий гексагистидиновый фрагмент.ПроцессполученияплазмидыpET-IL36Rafсостоялизследующихэтапов:последовательность гена ИЛ-36РА человека была оптимизирована по кодонному составу дляэкспрессии в клетках E. coli с помощью программы JCat [50], химически синтезирована(Евроген, Россия) и клонирована в вектор pET22b+ (Invitrogen, США) методом рестрикциилигирования.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
