Диссертация (1145685), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Также ИЛ-36 стимулируютпродукцию кератиноцитами и фибробластами хемокинов для нейтрофилов, ДК и T-лимфоцитов[132], стимулирует созревание ДК [95] и направляет дифференцировку T-лимфоцитов по Th1- иTh17-пути [138, 139]. В воспаленной коже при гидрадените наблюдается повышениеэкспрессии генов ИЛ-36α, β, γ, но не ИЛ-36РА [128].РольИЛ-36впатогенезепсориазапродемонстрированатакженамоделипсориазоподобного дерматита на мышах.Мыши, трансгенные по гену, кодирующему ИЛ-36α, имели фенотип кожиблизкий к псориатическому: локальные язвы с повышенной инфильтрациейиммунных клеток, нарушениями дифференцировки кератиноцитов, а такжегиперэкспрессей генов многих белков, ассоциированных с воспалением.
Однако ктретьей неделе кожа мышат имела нормальный фенотип, то есть хронизациивоспалительного процесса не происходило.Потомство от скрещивания этих мышей с мышами, нокаутными по гену,кодирующему ИЛ-36РА, было настолько маложизнеспособно, что из 109 мышатвыжил только один.Потомство от скрещивания с мышами, нокаутными по гену, кодирующемурецептор ИЛ-36, имело нормальный фенотип.Потомство от скрещивания этих мышей с мышами, нокаутными по генам,кодирующимрецепторИЛ-1илирецепторФНОα,имелотакойжепсориазоподобный фенотип.Потомство от скрещивания этих мышей с мышами, нокаутными по гену,кодирующим белок RAG-2, необходимому для V(D)J-реарранжировки, и поэтомунеспособных к рекомбинации генов Т-клеточного рецептора в процессесозревания T-лимфоцитов, имело псориазоподобный фенотип кожи.Таким образом, развитие этого псориазоподобного фенотипа у мышей опосредованосамими ИЛ-36, а ИЛ-1β и ФНОα и Т-лимфоциты не играют при этом критической роли [15, 22].27У человека при наличии мутаций в гене IL36RN, кодирующем ИЛ-36РА, можетразвиваться так называемый синдром недостаточности ИЛ-36РА (DITRA - deficiency of the IL36 receptor antagonist, OMIM 614204) [10, 158].
Для него характерны клинические проявления ввиде таких заболеваний как географический язык [80], герпетиформное импетиго [125],пальмоплантарный пустулез, акродерматит хронический Аллопо [3, 118] и генерализованныйпустулёзный псориаз (ГПП), который является его наиболее частым и наиболее тяжёлымклиническим проявлением [118]. У носителей гетерозиготных мутаций болезнь как правилоразвивается позже и протекает легче [58].Описан ряд мутаций, вызывающих это заболевание, наиболее распространённых вразличных популяциях: нонсенс мутация 28C>T (Arg10X) выявлена в японской и арабскойпопуляциях [110, 126], миссенс мутация 368C>T (Thr123Met) выявлена в японской популяции[37, 62], миссенс мутации 338C>T (Ser113Leu) и 142C>T (Arg48Trp), выявлены вВеликобритании [98], миссенс мутация 80T>C (Leu27Pro) выявлена в тунисской популяции[90], мутация 115+6T>C, приводящая к пропусканию экзона 3, сдвигу рамки считывания ипреждевременной терминации транскрипции, выявлена в японской популяции [37].
Для ИЛ36РА с аминокислотными заменами Thr123Met [37] и Leu27Pro [90] была экспериментальнодоказана потеря функциональной активности. Носителями мутантной аллели 80T>C (Leu27Pro)оказалось 0,52% тунисской популяции [90].2.2.4. Лечение псориаза и антицитокиновая терапияЛечение псориаза носит только симптоматический характер и выбирается в зависимостиот тяжести заболевания. Лёгкие формы вульгарного псориаза поддаются эффективномулечению с помощью топического применения препаратов растительного происхождения [36],кальцитриола или кальципотриола [102], бетаметазона дипропионата [148], кортикостероидов[131], антралина [117] и облучения ультрафиолетом В (длина волны 280–315 нм) [93].
В болеетяжёлых случаях, когда наблюдаются также системные расстройства или поражения суставов,вызванные псориазом, применяется ретиноидная терапия или метотрексат [64]. Наиболеетяжёлые формы псориаза, такие как ГПП, не отвечают на подобную терапию.ВнастоящеевремявтерапииГППнаиболееширокоприменяютсятакиеантицитокиновые иммуносупрессивные препараты, как этанерцепт (внеклеточный доменрецептора ФНОα, сшитый с Fc-фрагментом IgG1 человека), инфликсимаб и адалимумаб (оба –моноклональные антитела к ФНОα) [113].
Лечение ГПП этими препаратами нередко приводит к28развитию системных осложнений и инфекций, особенно у детей [113]. Так, при терапии ГПП спомощью этанерцепта у ряда пациентов развивался синдром раздражённого кишечника и увеит[45, 67]. Введение адалимумаба часто приводило к развитию различных инфекций [45, 66]. Вединичных случаях при введении инфликсимаба показано развитие тяжёлых заболеваний,такихкакдисфункцияпечени[143].Зарегистрированслучай,когдаприлеченииинфликсимабом у пациента развилась пневмоцистная пневмония – угрожающее жизнизаболевание обычно наблюдаемое у ВИЧ-инфицированных пациентов [105].В клинической практике распространены случаи успешного лечения ГПП / DITRA спомощью введения рекомбинантного рецепторного антагониста ИЛ-1 (анакинра) [111].Анакинра также показал высокую эффективность в лечении пациента с делецией 175 т.п.н.
нахромосоме 2q13, включающей гены, кодирующие ИЛ-1РА, ИЛ-36α, ИЛ-36β, ИЛ-36γ, ИЛ-36РАи ИЛ-38 [19]. Тем не менее, при лечении анакинрой у многих пациентов также наблюдаютсятяжёлые побочные эффекты, в первую очередь инфекции и токсическое поражение печени[172].Высокую эффективность в терапии ГПП показали также моноклональные антитела кИЛ-17А (секукинумаб) [112] и моноклональные антитела к общей для ИЛ-12 и ИЛ-23субъединице p40 (устекинумаб) [101].
Однако и в случае этих препаратов наблюдались частыепобочные эффекты в виде инфекций дыхательных путей и расстройств пищеварительнойсистемы, особенно при длительном лечении [84, 112].Описано также применение моноклональных антител к рецептору ИЛ-6 (тоцилизумаб)для лечения псориатического артрита, не отвечающего на лечение блокаторами ФНОα [30].Однако, лечение тоцилизумабом также имеет тяжёлые побочные эффекты, опосредованныеразвитием нейтропении [87].Таким образом, учитывая тяжесть побочных эффектов имеющейся антицитокиновойтерапии ГПП / DITRA, существует необходимость разработки препаратов, действие которыхограничивалось бы кожей.Перспективным вариантом представляется целенаправленное подавление активностиИЛ-36 [32]. В настоящее время разрабатывается несколько таких препаратов. Моноклональныеантитела к рецептору ИЛ-36 независимо получены компаниями Boehringer Ingelheim(Германия) [44] и Anaptys Bio (США) [156]. Сейчас они оба находятся на первой стадииклинических испытаний.29Разработка технологии получения фармацевтической субстанции рекомбинантного ИЛ36РА и готовой лекарственной формы на ее основе, являющейся кандидатным лекарственнымсредством для лечения псориаза, разрабатываемым ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА РФ (Россия),описана в данной работе.303.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1. Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РАВ создании штаммов-продуцентов ИЛ-36РА принимали участие Кондратьева Е.В. иКудлинг Т.В., за что автор приносит им свою искреннюю благодарность. При этом участиеавтора заключалось в постановке задач, разработке плана работ и предоставлении образцов.3.1.1. Штаммы бактерийВ ходе работ по созданию плазмид использовались клетки E.coli DH10B/R (Invitrogen,США) с генотипом F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM 15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1araD139 Δ(ara,leu)769 galU galKλ- rpsL nupG. Клетки этого штамма обладают высокойкомпетентностью при трансформации и малой склонностью к модификации или потереплазмид.В качестве штамма-продуцента использовали E.coli BL21 Star [DE3] (Invitrogen, США) сгенотипом F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm rne131 [DE3], содержащий в геноме λDe3 лизоген имутацию rne131.
Мутация rne131 в гене rne приводит к наработке усеченной формы РНКазы-Е,что замедляет деградацию мРНК внутри клетки. Использование этого штамма позволяетувеличивать продукцию белка.3.1.2. Получение компетентных клеток E.coli для электротрансформацииДля получения клеток обоих описанных выше штаммов, компетентных к последующейтрансформации методом электропорации, клетки переводили в деионизованную воду изамораживали. Для этого штамм рассеивали на чашку Петри с с агаризованной средой LB.Чашку инкубировали в термостате при +37 °С в течение ночи. На следующий день брали счашки отдельную колонию и помещали в 5 мл 1-кратной жидкой среды LB.
Культуру растили втечение 16-18 часов при +37 °С и скорости перемешивания 250 об/мин. 2 мл полученнойночной культуры вносили в 200 мл 1-кратной среды LB в 2 л колбе. Полученную культурурастили при +37 °С и скорости перемешивания 250 об/мин до достижения OD600 = 0,6. Затемклетки осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 10 минут при +4 °С. После этогоклетки отмывали 200 мл деионизованной воды и осаждали центрифурированием при тех жеусловиях.Процедуруотмывкиповторялитрижды.Послеотмывкиосадокклетокресуспендировали в 50 мл деионизованной воды, разливали по 500 мкл в микроцентрифужные31пробирки и центрифугировали 30 секунд при 6000 g на микроцентрифуге. Осадок клетокресуспендировали в 35 мкл 15% глицерина, сразу после этого пробирку быстро замораживали вжидком азоте.
Готовые к трансформации клетки хранили при -70 °С.3.1.3. Электротрансформация клеток E. coliТрансформацию компетентных клеток проводили методом электропорации. Для этогоодин микролитр деионизованной лигазной смеси добавляли к 40 мкл компетентных клеток,перемешивали и проводили электропорацию на электропораторе MicroPulser (Bio-Rad, США) встерильных ячейках. После трансформации клетки помещали в 300 мкл cреды SОС (2%триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20мМ глюкозы) и инкубировали в течение 40 минут при + 37 °С. После инкубации 10–100 мклклеточной суспензии высеивали на чашку Петри с агаризованной средой LB, содержащей 100мкг/мл ампициллина и/или 25 мкг/мл хлорамфеникола для отбора трансформированныхклонов.3.1.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
