Диссертация (1145685), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Отбор трансформированных клоновОтбор трансформированных клонов проводили с помощью ПЦР с колоний. Для этогофрагмент биомассы бактериальной колонии с помощью стерилизованной деревяннойзубочистки переносили с поверхности чашки Петри в 200 мкл пробирку с 15 мкл реакционнойсмеси для ПЦР, содержащей в том числе необходимую для определения требуемого гена парупраймеров.
Зубочисткой с остатками биомассы бактерий наносили штрих на чистую чашкуПетри с 1-кратной агаризованной средой LB, содержащей соответствующий антибиотик.Чашки помещали на ночь в термостат при температуре + 37 °С. ПЦР проводили по программе,соответствующей конкретной паре праймеров. Результат ПЦР визуализировали с помощьюэлектрофорезав2%агарозномгеле.ВслучаеположительногорезультатаПЦРсоответствующую колонию использовали в дальнейшей работе.3.1.5.
Создание экспрессионных плазмид, несущих ген метиониаминопептидазы E.coliКонструирование плазмиды pBAD2232На первом этапе модифицировали плазмиду pBAD (Thermo Scientific, США): удалялиучасток плазмиды, содержащий сайт рестрикции NdeI и заменяли исходный полилинкер наполилинкер плазмиды pET22b(+) (Novagen, США).
С этой целью проводили амплификациюфрагмента плазмиды pBAD с помощью пары 5’-фосфорилированных праймеров (длинапродукта 3885 п.н.): 5’-GCTGCATGTGTCAGAGGTT-3’ и 5’-GCACAGATGCGTAAGGAGAA3’.Амплифицированный фрагмент обрабатывали 1 ед. лигазы фага Т4 (Thermo Scientific,США), что привело к его замыканию в кольцо. Полученную плазмиду использовали в качествематрицы во второй ПЦР со следующей парой праймеров (длина продукта 3793 п.н.): 5’ATGCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTT-3’ и 5’-TAAGACGTCTCCAGCTTGGCTGT-3’.Параллельно проводили ПЦР участка полилинкера на матрице pET22b(+) с помощьюследующей пары праймеров (длина продукта 256 п.н.): 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’ и5’-AGCGACGTCTTATCAGTGGTGGTGGTGGT-3’.Концы амплифицированных фрагментов ДНК обрабатывали рестриктазами NdeI и AatIIи лигировали друг с другом.
В результате была получена плазмида pBAD22, несущая ген беталактамазы, ориджин репликации pBR322, а также регулирующие элементы и промотор оперонаaraBAD.Здесьидалееправильностьпоследовательностиплазмидыподтверждалисеквенированием с использованием форвард-праймера для клонирования.Конструирование плазмиды pRhD(-)Для создания плазмиды pRhD(-) амплифицировали последовательность полилинкера наматрицеплазмидыpET22b(+)(Novagen,США)спомощьюпраймеров:иATACATATGAAATACCTGCTGCCGA-3’5’5’-TTTGCTAGCATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCA-3’.Амплифицированный фрагмент длиной 305 п.н.
и плазмиду pET302/NT-His (ThermoFisher Scientific, США) обрабатывали рестриктазами NdeI и NheI, затем лигировали с помощьюлигазы фага Т4. Так была получена плазмида pET322.Затем на матрице генома E. coli штамма DH10B (Invitrogen, США) амплифицировалифрагмент (длина продукта 2030 п.н.), содержащий регуляторную часть оперона rhaBAD. ДляэтогоиспользовалипраймерыTTTGTATACAATTAATCTTTCTGCGAATTGAGATGACGCC-3’TTATCTAGATTCATTACGACCAGTCTAAAAAGCGCCT-3’.5’и5’-33Амплифицированный фрагмент длиной 2030 п.н. и плазмиду pET322 обрабатывалирестриктазами AccI и XbaI (Thermo Fisher Scientific, США), затем лигировали с помощьюлигазы фага Т4 (Thermo Fisher Scientific, США).
Так была получена плазмида pRhD(-), котораянесёт ген бета-лактамазы и регулирующие элементы и промотер оперона rhaBAD.Конструирование экспрессионных векторов pRhD(-)/MAP, pET302/MAP и pBAD22/MAPПоследовательность гена метионинаминопептидазы (map) E. coli амплифицировали сгеномнойДНКклетокE.coliштаммаBL21[DE3]спомощьюпраймеровиGAACATATGGCTATCTCAATCAAGACCCCA-3’5’5’-GAACTCGAGTTATTATTCGTCGTGCGAGATTA-3’.Амплифицированный фрагмент длиной 800 п.н. и плазмиды pRhD(-) и pBAD22обрабатывали рестриктазами NdeI и XhoI, затем лигировали с помощью лигазы фага Т4. Такбыли получены плазмиды pRhD(-)/MAP и pBAD22/MAP, несущие ген map под контролемпромотора rhaBAD или araBAD соответственно, ген бета-лактамазы и ориджин репликацииpBR322.ДляклонированиягенаметионинаминопептидазывплазмидуpET302/NT-Hisпоследовательность гена метионинаминопептидазы (map) E.
coli амплифицировали с геномнойДНКклетокE.coliштаммаBL21[DE3]спомощьюиGAATTCAGCTATCTCAATCAAGACCCCA-3’праймеров5’5’-GGATCCTTATTATTCGTCGTGCGAGATTA-3’.Амплифицированныйфрагментдлиной800п.н.иплазмидуpET302/NT-Hisобрабатывали рестриктазами EcoRI и BamHI, затем лигировали с помощью лигазы фага Т4. Такбыла получена плазмида pET302/MAP.Конструирование плазмиды pRh15AФрагмент последовательности ДНК, содержащий ген метионинаминопептидазы ирегулирующие его экспрессию последовательности, амплифицировали с плазмиды pRhD()/MAP с помощью праймеров 5’-GCTAAGCTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTC-3’ и 5’GGAGTCGACATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3’.Амплифицированный фрагмент длиной 3146 п.н.
и плазмиду pACYC184 обрабатывалирестриктазами HindIII и SalI, затем лигировали с помощью лигазы фага Т4. Так была получена34плазмида pRh15A, несущая ген map под контролем промотора rhaBAD, ген бета-лактамазы иориджин репликации p15A.Конструирование плазмиды pBAD15AФрагмент последовательности ДНК, содержащий ген МАП и регулирующие егоэкспрессию последовательности, амплифицировали с плазмиды pBAD22/MAP с помощьюпраймеров5’-иGATAAGCTTCTGTGCGCTGCATGTGTCAGAG-3’5’-GAAGTCGACGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCAC-3’.Амплифицированный фрагмент длиной 2529 п.н.
и плазмиду pACYC184 обрабатывалирестриктазами HindIII и SalI, затем лигировали с помощью лигазы фага Т4. Так была полученаплазмида pBAD15A, несущая ген map под контролем промотора araBAD, ген бета-лактамазы иориджин репликации p15A.Конструирование плазмиды pET15AФрагмент последовательности ДНК, содержащий ген метионинаминопептидазы ирегулирующиеегоэкспрессиюпоследовательности,амплифицировалисплазмидыpET302/MAP с помощью праймеров 5’-GTTAAGCTTCGGGTTACTGATGATGAACATG-3’ и5’-GGAGTCGACATCCGGATATAGTTCCTCCTTTC-3’.Амплифицированный фрагмент длиной 3755 п.н. и плазмиду pACYC184 обрабатывалирестриктазами HindIII и SalI, затем лигировали с помощью лигазы фага Т4. Так была полученаплазмида pET15A, несущая ген map под контролем промотора T7/lac, ген бета-лактамазы иориджин репликации p15A.3.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РАВ работах по культивированию созданных штаммов-продуцентов ИЛ-36РА принималиучастие сотрудники ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» Кондратьева Е.В., Лисицкая В.И., Батарин В.И.
иДемьянова Е.В., за что автор приносит им свою искреннюю благодарность. Участие авторазаключалось в планировании работ, подготовке и анализе исходных и получаемых образцов,проведении экспериментов, разработке методик, обобщении, систематизации и интерпретациирезультатов работ.35Работы по культивированию штамма-продуцента ИЛ-36РА в пилотном биореакторепроводились на базе ИБФМ РАН под руководством к.б.н. Самойленко В.А..3.2.1. Криоконсервация культур штаммов-продуцентов ИЛ-36РАПосле завершения создания штамма и перед началом его серийных культивированийбыл создан криоконсервированный эталон каждого штамма-продуцента ИЛ-36РА. Штамм,выращенный в ночной культуре в 1-кратной среде LB, рассевали штрихом на чашку Петри,содержащую 25 мл питательной среды 1-кратной среды LB с агаром.
Чашку выдерживали втермостате при температуре +37 °С в течение 18 часов, после чего просматривали, выделяли 10типичных изолированных колоний (гладкие, слабовыпуклые, с ровным краем). Выбранныеколонии суспендировали в стерильной пробирке, содержащей 1 мл 0,15 М хлористого натрия,до получения равномерной суспензии и переносили в коническую колбу с 30 мл 1-кратнойсреды LB. Колбу помещали в термостатированную качалку при скорости перемешивания 250об/мин и температуре +37 °С на 18 часов.
Из полученной культуральной жидкости стерильноотбирали 10 мл для контроля чистоты и стабильности культуры, а также качества плазмиды.К оставшейся культуральной жидкости добавляли 10 мл 45% глицерина и перемешивалидо получения гомогенной суспензии, которую затем разливали стерильной пипеткой по 1,5 млв 20 стерильных пробирок и замораживали при -70 °С.3.2.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в колбахНа первом этапе работ созданные штаммы-продуценты ИЛ-36РА культивировали вколбах. Культивирование бактерий осуществляли в 1,5-кратной среде LB.
В качествеселектирующегоагентаприменялиампициллинвконцентрации100мкг/л.Прикультивировании штаммов, несущих две плазмиды, добавляли хлорамфеникол в концентрации25 мкг/л. Культуру объёмом 10 мл в колбе объёмом 100 мл засевали, используя аликвотукриоконсервированной культуры, до плотности 0,1 ОЕ, растили 16 часов при +37 °С прискорости перемешивания 250 об/мин. Затем культуру инокулировали в 200 мл 1,5-кратнойсреды LB, до плотности 0,3 OE и растили в колбе объёмом 2 л при +37 °C до плотности 3ОЕ/мл. После этого температуру понижали до +30 °С и вносили индукторы: во все колбы –ИПТГ в концентрации 0,5 мМ, а при культивировании штаммов, несущих плазмиды pRh15A иpBAD15A, также рамнозу в концентрации 0,02% или арабинозу в концентрации 0,2%,соответственно. Длительность индукции составляла 3 часа. Биомассу бактерий собиралицентрифугированием со скоростью 10000 g при +4 °C в течение 30 минут и замораживали притемпературе -70 °С.363.2.3.
Культивированиештаммов-продуцентовИЛ-36РАвбиореакторе(ферментере)В дальнейшем при увеличении масштабов культивирования штамма Escherichia coliBL21Star[DE3](pET-IL36Raf,сталиpBAD15A)использоватьбиореакторBIOFLO-110(NewBrunswick, США) с ёмкостями 1 и 10 литров. Эти ёмкости специально сконструированыдлямасштабированиякультивирования,ониобладаютаналогичнымипараметрамимассообмена, отличающимися только количествами используемых материалов в 10 раз. В связиэтим ниже описано только культивирование в ёмкости 10 л, как наиболее важной для работы.Пробиркуcкриоконсервированнойкультуройштамма-продуцентаИЛ-36РАразмораживали в термостате при +37 °С в течение 5 минут. Затем содержимое пробирки встерильных условиях вносили поровну в четыре колбы вместимостью 2,0 л, содержащую 0,2 л1,5-кратнойсредыLB,дополненной1-кратнойсредойM9.Культурырастиливтермостатируемой качалке в течение 18 часов при +37 °С и скорости перемешивания 250об/мин.Ферментер BIOFLO-110 (NewBrunswick, США) подготавливали согласно инструкции поэксплуатации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
