Диссертация (1145685)
Текст из файла
Федеральное Государственное Бюджетное ОбразовательноеУчреждение Высшего Образования«Санкт-Петербургский Государственный Университет»На правах рукописиКОЛОБОВ АЛЕКСЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТАГОНИСТАРЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА 36 ЧЕЛОВЕКА ИИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ИБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ03.01.04 – биохимияДиссертацияна соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:кандидат биологических наук, доцентВасилий Евгеньевич СтефановСанкт-Петербург20172ОГЛАВЛЕНИЕВведение ............................................................................................................................ 71.1.1.Актуальность темы исследования...............................................................................
71.2.Степень разработанности темы ................................................................................... 81.3.Цель ................................................................................................................................ 81.4.Методология и методы исследования ........................................................................ 91.5.Научная новизна ...........................................................................................................
91.6.Теоретическая и практическая значимость работы .................................................. 91.7.Положения, выносимые на защиту ........................................................................... 101.8.Апробация результатов .............................................................................................. 101.9.Личное участие автора в получении результатов ................................................... 111.10.Структура и объём диссертации ............................................................................
11Обзор литературы .......................................................................................................... 122.2.1.Структура и функции цитокинов группы ИЛ-36 .................................................... 122.1.1. ИЛ-36 как члены семейства ИЛ-1 .......................................................................
122.1.2. Структура генов ИЛ-36 ........................................................................................ 132.1.3. Профиль экспрессии генов ИЛ-36 ...................................................................... 142.1.4. Структура белков семейства ИЛ-36 и их рецепторов ....................................... 152.1.5.
Секреция ИЛ-36 .................................................................................................... 172.1.6. Пост-трансляционные модификации и процессинг ИЛ-36 .............................. 182.1.7. Сигналлинг белков семейства ИЛ-1 ................................................................... 202.1.8.
Биологические функции ИЛ-36 .......................................................................... 212.2.Псориаз и цитокины группы ИЛ-36 ......................................................................... 222.2.1. Клинико-демографическая характеристика псориаза ...................................... 222.2.2. Современные представления о патогенезе псориаза ........................................
232.2.3. Роль ИЛ-36 в патогенезе псориаза ...................................................................... 2532.2.4. Лечение псориаза и антицитокиновая терапия ................................................. 27Материалы и методы исследования ............................................................................. 303.3.1.Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА .......................... 303.1.1. Штаммы бактерий ................................................................................................ 303.1.2. Получение компетентных клеток E.coli для электротрансформации .............
303.1.3. Электротрансформация клеток E. coli ................................................................ 313.1.4. Отбор трансформированных клонов .................................................................. 313.1.5. Создание экспрессионных плазмид, несущих ген метиониаминопептидазы E.coli313.2.Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА ............................................... 343.2.1.
Криоконсервация культур штаммов-продуцентов ИЛ-36РА........................... 353.2.2. Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в колбах ......................... 353.2.3. Культивированиештаммов-продуцентовИЛ-36РАвбиореакторе(ферментере) 363.3.Лизис биомассы клеток штаммов-продуцентов ИЛ-36РА ..................................... 373.4.Осветление лизата биомассы клеток штамма-продуцента ИЛ-36РА.................... 383.4.1. Флоккуляция ......................................................................................................... 383.4.2.
Кислотное фракционирование ............................................................................ 383.5.Хроматографическая очистка ИЛ-36РА................................................................... 393.5.1. Анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow ............ 393.5.2.
Катионообменная хроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow ......... 403.5.3. Гидрофобная хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650S .................... 413.5.4. Аффинная хроматография на сорбенте с иммобилизованными антителами кИЛ-36РА413.5.4.1. Иммобилизация антител на сорбенте .............................................................. 413.5.4.2. Аффинная хроматография ................................................................................
423.6.Ультрафильтрационное концентрирование раствора ИЛ-36РА ............................ 4343.7.Диск-электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия .................... 443.8.Вестерн блот для определения ИЛ-36РА ................................................................. 443.9.Очистка растворов от ЛПС с помощью обработки Triton X-114........................... 453.10.Очистка растворов от Triton X-114 с помощью диализа ....................................
453.11.Количественное определение ЛПС ....................................................................... 463.12.Количественное определение содержания ИЛ-36РА в растворах ..................... 463.12.1. Спектрофотометрическое определение ........................................................... 463.12.2. Биуретовый метод с бицинхонициновой кислотой ........................................ 463.12.3.
Определение концентрации ИЛ-36РА методом ИФА .................................... 473.13.Оценка биологической активности ИЛ-36РА in vitro с использованием тест-системы на основе клеточной линии А549 .................................................................................... 483.13.1. Культивирование клеток А549+36 ...................................................................
483.13.2. Оценка биологической активности ИЛ-36РА ................................................. 483.13.3. Определение концентрации ИЛ-8 методом ИФА ........................................... 493.13.4. Расчет активности образцов ИЛ-36РА ............................................................. 493.14.Искусственное окисление ИЛ-36РА ..................................................................... 493.15.Искусственное дезамидирование ИЛ-36РА .........................................................
503.16.ВЭЖХ анализ чистоты и гомогенности ИЛ-36РА............................................... 503.16.1. ОФ-ВЭЖХ для определения чистоты ИЛ-36РА ............................................. 503.16.2. ОФ-ВЭЖХ для определения примеси непроцессированной и окисленнойформ ИЛ-36РА 513.16.3.
ОФ-ВЭЖХ для определения примеси Triton X-114 ........................................ 513.16.4. ГП-ВЭЖХ для определения агрегатов ИЛ-36РА ............................................ 513.17.Определение примеси дезамидированной формы ИЛ-36РА с помощьюкапиллярного изоэлектрофокусирования ...................................................................................... 513.18.Динамическое светорассеяние............................................................................... 523.19.Статистическая обработка результатов ................................................................ 535Результаты и обсуждение .............................................................................................. 544.4.1.ИЛ-36РАПолучение штамма-продуцента ИЛ-36РА, исследование биологических свойств544.1.1.
Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА на основе E.coli BL21[DE3] .............................................................................................................................. 544.1.2. Оптимизация условий индукции экспрессии гена ИЛ-36РА штаммамипродуцентами безметионинового ИЛ-36РА...............................................................................
614.1.3. Выбор наиболее продуктивного штамма-продуцента безметионинового ИЛ36РА664.1.4. Изучение биологической активности ИЛ-36РА ................................................ 704.1.4.1. Сравнение биологической активности ИЛ-36РА от различных штаммов-продуцентов704.1.4.2. БиологическаяактивностьИЛ-36РАвмоделипсориазоподобногодерматита на мышах .....................................................................................................................
724.1.5. Масштабирование культивирования штамма-продуцента безметиониновогоИЛ-36РА4.2.75Разработка методики хроматографической очистки ИЛ-36РА, исследованиефизико-химических свойств ИЛ-36РА ........................................................................................... 794.2.1. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в исследовательском масштабе,исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА ............................................................... 794.2.1.1. Отработка условий лизиса биомассы штамма-продуцента в лабораторноммасштабе794.2.1.2. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в лабораторном масштабе ............
804.2.1.3. Изучение гетерогенности ИЛ-36РА ................................................................ 844.2.1.4. Оптимизация условий хранения ИЛ-36РА ..................................................... 934.2.2. Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА вмасштабе лабораторного производства ...................................................................................... 974.2.2.1. Оптимизация метода лизиса биомассы штамма-продуцента и осветлениелизатов методом флоккуляции .................................................................................................... 9764.2.2.2. МасштабированиеметодаочисткиИЛ-36РАсприменениеманионообменной хроматографии .............................................................................................. 1014.2.2.3.
Очистка ИЛ-36РА от ЛПС с помощью разделения фаз с Triton X-114 ..... 1044.2.2.4. Метод очистки ИЛ-36РА с применением анионообменной хроматографии:материальный баланс.................................................................................................................. 1094.2.3. Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА вмасштабе пилотного промышленного производства ..............................................................
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
