Диссертация (1145685), страница 3
Текст из файла (страница 3)
2017 Получение ИЛ-36РА человека в Escherichia coli прикоэкспресии с метионинаминопептидазой E. coli. II. Сравнение биологической активности ИЛ36РА от различных штаммов. Цитология. 59 (8): 534-53811Также результаты работы представлены на ряде конференций: в виде постерныхдокладов на конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и егоздоровье» (Санкт-Петербург 2015, 2016, 2017) и в виде устного доклада на всероссийскомнаучном форуме «Дни Иммунологии» (Санкт-Петербург, 2017).Всего по теме диссертации опубликовано 2 статьи, 5 тезисов докладов и подана 1 заявкана патент РФ (№ 2017103888 от 06.02.2017).Работа прошла практическую апробацию. Препарат ИЛ-36РА, полученный поразработанной методике, успешно прошёл доклинические испытания в качестве кандидатноголекарственного средства для терапии тяжёлых форм псориаза.1.9.
Личное участие автора в получении результатовЛичный вклад автора состоит в личном участии в проведении всех этапов работ: ворганизации и проведении экспериментов, планировании работ, подборе и оптимизациипроизводственных и аналитических методик, теоретическом обобщении и статистическойобработке результатов, подготовке к публикации статей, патентов и отчётов по теме, а также вруководстве научной группой.
Экспериментальная часть работы выполнена на базе ФГУП«Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России.Ряд исследований проведён совместно с сотрудниками ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ»Кондратьевой Е.В., Кудлинг Т.В. (генная инженерия) и к.м.н. Петровым А.В. (тестированиебиологической активности ИЛ-36РА). Работы по культивированию штамма-продуцента ИЛ36РА в пилотном биореакторе проводились на базе ИБФМ РАН под руководством к.б.н.Самойленко В.А..Все полученные совместно результаты опубликованы или в настоящее время по нимготовятся совместные публикации.
Соискатель приносит соавторам и коллегам своюискреннюю благодарность.1.10.Структура и объём диссертацииДиссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов,результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на169 страницах машинописного текста, иллюстрирована 58 рисунками, 5 таблицами и 1приложением. Список литературы содержит 178 литературных источников.122. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ2.1.
Структура и функции цитокинов группы ИЛ-362.1.1. ИЛ-36 как члены семейства ИЛ-1Cемейство ИЛ-1 включает 12 членов (Таблица 1). Группа интерлейкинов 36 (ИЛ-36)входит в него и включает три провоспалительных цитокина ИЛ-36 α, β, γи одинпротивовоспалительный – рецепторный антагонист интерлейкинов 36 (ИЛ-36РА) [48]. Все онибыли открыты в 1999-2000 годах [11, 71, 123, 167] и фигурируют в литературе под рядомразличных названий. Современная номенклатура белков семейства ИЛ-1 была утверждена в2010 году [33] (Таблица 1).Таблица 1.
Цитокины семейства ИЛ-1, их рецепторы и функции [121, 152].НазваниеСинонимыРецепторКорецепторОсновная функцияИЛ-1αIL-1F1IL-1RIIL-1RAcPПровоспалительнаяИЛ-1βIL-1F2IL-1RIIL-1RAcPПровоспалительнаяИЛ-1РАIL-1F3IL-1RI–Рецепторный антагонистИЛ-18IL-1F4IL-18RαIL-18RβПровоспалительнаяИЛ-33IL-1F11IL-1RL1IL-1RAcРПровоспалительнаяИЛ-36αIL-1F6, IL-1εIL-36RIL-1RAcPПровоспалительнаяИЛ-36βIL-1F8, IL-1H2, IL-1ηIL-36RIL-1RAcPПровоспалительнаяИЛ-36γIL-1F9, IL-1H1, IL-1ε, IL-36RIL-1RAcPПровоспалительная–Рецепторный антагонистIL-1F7, IL-1RP1, IL-1H, IL-18RαIL-1R8 (TIR8,ПротивовоспалительнаяIL-1H4, IL-1ζIL-1RAPL-1,IL-1RP2ИЛ-36РАIL-1F5, IL-1δ, IL-1RP3, IL-36RIL-1HY1, IL-1L1ИЛ-37SIGIRR)ИЛ-38IL-1F10, IL-1θ, IL-1HY2 IL-36R–Противовоспалительная13В настоящее время ИЛ-36 рассматриваются как часть суперсемейства ИЛ-1 [121], т.к.они имеют ряд общих свойств.
В первую очередь это структурная близость самих молекул [53]и их рецепторов [150]. Так, хотя рецепторной субъединицей ИЛ-1 (ИЛ-1 α, β и ИЛ-1РА)является IL-1R1 [142], а рецепторной субъединицей ИЛ-36 (ИЛ-36 α, β, γ и ИЛ-36РА) являетсяIL-36R, корецепторная субъединица у обеих групп общая – IL-1RAcP [48].Для ИЛ-36, как и для ИЛ-1, характерна регуляция воспаления по принципу обратнойсвязи с помощью рецепторных антагонистов соответствующих цитокинов (ИЛ-1РА, ИЛ-36РА).Они способны связывать рецептор, не активируя его, т.к.
их связывание делает невозможнойдимеризацию рецептора с корецептором [53]. Причиной ряда хронических воспалительныхзаболеваний являются мутации в генах рецепторных антагонистов ИЛ-1 [158] и ИЛ-36 [118].Большая часть белков семейства ИЛ-1 синтезируется в виде биологически неактивныхпредшественников, для активации которых необходим протеолиз [4].2.1.2. Структура генов ИЛ-36Высокая схожесть свойств различных членов семейства ИЛ-1 может указывать на ихэволюционное родство [34]. В пользу этого также говорит близкое расположение генов всехчленов семейства ИЛ-1 кроме ИЛ-18 [97] и ИЛ-33 [116] на длинном плече второй хромосомы(2q13) [96].
Гены цитокинов ИЛ-1α, ИЛ-1β и ИЛ-1РА находятся в интервале 430 т.п.н. Междугенами, кодирующими ИЛ-1β и ИЛ-1РА, в интервале 300 т.п.н. находятся гены, кодирующиеИЛ-37, ИЛ-36γ, ИЛ-36α, ИЛ-36β, ИЛ-36РА и ИЛ-38 [96] (Рисунок 1).Рисунок 1. Схема расположения генов цитокинов семейства ИЛ-1 на длинном плечевторой хромосомы человека (2q13) [174].14Близость генов семейства ИЛ-1 на хромосоме может определять возможность ихсовместной транскрипции одним комплексом транскрипционных факторов [119]. Вероятно, этоявляется одним из механизмов регуляции функции этих генов.В генах большинства членов семейства ИЛ-1 присутствуют три т.н.
общих экзона(common exons, CE). Они кодируют последовательность центральной части молекулы белка,состоящей из двенадцати β-складок (S1-S12) с одиннадцатью петлями. Экзон CE1 кодируетмотивы S1-S3, CE2 кодирует S4-S6 и большую часть S7, а CE3 кодирует остаток S7 и S8-S12[35, 96].Часть представителей группы ИЛ-36 имеет иное строение генов. Гены ИЛ-36α и ИЛ36РА устроены типично [21]. Ген ИЛ-36α содержит четыре экзона, из них экзон 1 кодирует 5’нетранслируемую область, а экзоны 2-4 соответствуют общим экзонам CE1-CE3 [21]. Ген ИЛ36β имеет 6 экзонов, из них экзон 1 кодирует 5’ нетранслируемую область, а остальныекодируют последовательность белка.2.1.3.
Профиль экспрессии генов ИЛ-36Экспрессия генов ИЛ-36 происходит в норме в ряде тканей, преимущественноэпителиальных, и активируется при развитии воспаления. В коже наиболее активноэкспрессируется ген IL36G, кодирующий ИЛ-36γ. Его экспрессия фиксируется в кератиноцитахдифференцирующихсяслоевэпидермиса,ноневмеланоцитах,фибробластахилиэндотелиоцитах [123]. Слабая экспрессия генов ИЛ-36α, β, γ показана также в миндалинах,легких, кишечнике, пищеводе [34], мозге [48] и в клетках иммунной системы: дендритныхклетках [132], моноцитах/макрофагах, Т-лимфоцитах [103] и нейтрофилах [18].Наибольшую роль в развитии воспаления в коже играет ИЛ-36γ, т.к.
среди всехпровоспалительных ИЛ-36 только он конститутивно продуцируется в коже [32] и его уровеньсильнее всего повышается при псориатическом воспалении [163]. Увеличение экспрессии генаIL36G в коже обнаруживается также на фоне реакции гиперчувствительности [34]. В клеткахэпителия трахеи и бронхов повышенная экспрессия гена IL36G наблюдался у пациентов састмой в ответ на контакт с антигеном [133, 163].Изучение промоторной области IL36G показало, что одним из транскрипционныхфакторов, активирующих его экспрессию в клетках миелоидного ряда, является T-bet [155].Этот фактор играет ключевую роль в развитии Тх-1 иммунного ответа и выработке ИФНγ [74].Однако, этот фактор не продуцируется кератиноцитами, и поэтому не важен для продукции15основной массы ИЛ-36γ.
В кератиноцитах одним из активаторов экспрессии IL36G являетсяфактор Nrf2, стимулирующий также пролиферацию кератиноцитов [72]. При этом обработкаИЛ-36γ также стимулирует пролиферацию кератиноцитов, формируя таким образом петлюположительной обратной связи, вероятно, играющую ключевую роль в хроническихвоспалительных заболеваниях кожи [72].Экспрессия IL36G в клетках эпителия бронхов [27] и кератиноцитах [22, 79]стимулируется фактором некроза опухоли α (ФНОα), ИЛ-17, ИЛ-1β и интерфероном γ (ИФНγ).Наиболее сильно экспрессия гена IL36G повышалась в ответ на совместную обработку паройИЛ-1β и ФНОα или ИЛ-17A и ИЛ-22, однако ИЛ-22 сам по себе такого эффекта не давал [163].Экспрессия IL36G активируется также лигандами Toll-like рецепторов (TLR), такими какдвуцепочечная РНК или её синтетический аналог полиинозин-полицитидиловая кислота (pI:C)и флагеллин [79].
Кератиноциты ротовой полости человека отвечали повышением экспрессииIL36G, но не секрецией ИЛ-36γ на обработку лизофосфатидной кислотой, обычно применяемойкак активатор ранозаживления [129].Конститутивная экспрессия гена IL36RN, кодирующего ИЛ-36РА, наблюдается преждевсего в кератиноцитах, приэтом уровень ее повышается в псориатических бляшках [15]. IL36RNтакже экспрессируется в почках, мозге и тимусе, преимущественно в эпителиальных клетках,либо клетках макрофагального ряда [11, 96, 163].Ген IL1RL2, кодирующий специфический рецептор ИЛ-36, экспрессируется в коже,лёгких, яичках и глиальных клетках мозга [13, 85] в следующих типах клеток: в кератиноцитахи клетках эпителия почечных канальцев, эпителиоцитах бронхов и альвеол, фибробластахдермы, бронхов и легких [27, 133], синовиальных фибробластах и суставных хондроцитах [88],адипоцитах [9], моноцитах и макрофагах [138], а также в зрелых дендритных клетках (ДК)моноцитарного происхождения и плазмоцитоидных ДК, но не миелоидных ДК [95], микроглииЦНС [6].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
