Диссертация (1145685), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Коэффициент разбавлениясоставлял 500-1000х с учётом одной смены растворов, 500х принимался за минимальныйдостаточный. Раствор ИЛ-36РА помещали в диализный мешок CelluSep T2 MWCO 6-8 кДа(MFPI, США), фиксировали клипсами на обоих концах, помещали в стеклянный стакан,заполненный количеством буфера, необходимым для достижения нужного коэффициентаразбавления. Содержимое стакана перемешивали на магнитной мешалке при +4 °С в течениеночи, затем после смены раствора в течение 4 часов.46Количественное определение ЛПС3.11.В определении концентрации ЛПС в предоставленных автором образцах принималиучастие Минаева Е.Н. и Скворцов Н.В., за что автор приносит свою искреннюю благодарность.Количественное определение примеси ЛПС проводили с помощью набора ChromoLAL(Cape Cod Inc., США) по протоколу производителя.
В качестве стандарта использовали ЛПС изEscherichia coli K-235 (Sigma-Aldrich, Германия). Сигнал считывали с помощью прибора Victor2 (Wallac, США), измеряя поглощение раствором в лунках света при длине волны 405 нм.Концентрацию ИЛ-36РА в пробах рассчитывали по калибровочной кривой с учётомразбавления.3.12.Количественное определение содержания ИЛ-36РА в растворах3.12.1.Спектрофотометрическое определениеВ случаях, когда не требовалось поддерживать стерильность или апирогенностьрастворов ИЛ-36РА, а также позволяли объём и чистота проб, концентрацию ИЛ-36РАопределяли спектрофотометрически по поглощению раствора при длине волны 280 нм.
Дляэтого с помощью спектрофотометра Leki SS2109UV (ЛОИП, Россия) измеряли поглощениепробы сравнения - буферного раствора, не содержащего белка. Затем определяли поглощениесвета раствором ИЛ-36РА, вычитали из полученного значения значение, полученное прианализе пробы сравнения. Если полученное значение не попадало в линейный диапазонизмерения поглощения для данного прибора (0,1-0,5 единиц поглощения), то пробу илиразводили, или анализировали иным методом.На основании полученного значения рассчитывали концентрацию ИЛ-36РА в мг/мл висследуемом образце. Для этого полученное значение делили на коэффициент молярнойэкстинкции ИЛ-36РА (1,42), рассчитанный с помощью пакета программ ProtParam [47].3.12.2.Биуретовый метод с бицинхонициновой кислотойВ случаях, когда требовалось поддерживать стерильность или апирогенность растворовИЛ-36РА, а также в случаях, когда объём проб был мал, но они содержали чистый ИЛ-36РА,концентрацию ИЛ-36РА определяли с помощью модификации биуретового метода сиспользованием бицинхонициновой кислоты набором Pierce BCA Protein Assay Kit (ThermoScientific, США).
Набор использовали согласно инструкции производителя.473.12.3.Определение концентрации ИЛ-36РА методом ИФАВ проведении экспериментов по анализу образцов, предоставленных автором, методомИФА принимала участие Кондратьева Е.В., за что автор приносит свою благодарность. Участиеавтора состояло в получении и подготовке образцов, постановке задач, обобщении иинтерпретации результатов.В случаях, когда растворы ИЛ-36РА содержали много примесей, концентрацию ИЛ36РА определяли с помощью иммуноферментного анализа.
Тест-система для количественногоопределения ИЛ-36РА была разработана во ФГУП «ГосНИИ ОЧБ». В ней использованымоноклональные антитела мыши к ИЛ-36РА человека и поликлональные антитела кролика кИЛ-36РА человека.Для определения ИЛ-36РА в растворах в лунки плоскодонной платы с высокойсорбционной способностью вносили моноклональные антитела к ИЛ-36РА (20 мкг/мл, 100мкл/лунку) и инкубировали плату при +37 °С в течение ночи. На следующий деньанализируемые образцы и стандартные пробы ИЛ-36РА для калибровки разводили фосфатносолевым буфером с 1% бычьим сывороточным альбумином в требуемых разведениях. Послеразведения проб плату однократно промывали фосфатно-солевым буфером.
Затем в лункивносили по 100 мкл буфера для разведения образцов и 25 мкл разведённых проб, ставили платуна мешалку на 1 час при комнатной температуре. После этого пять раз отмывали платуфосфатно-солевым буфером и вносили 100 мкл раствора вторичных антител (поликлональныеантитела кролика к ИЛ-36РА) в концентрации 5 мкг/мл, ставили плату на мешалку на 1 час прикомнатной температуре.
После этого пять раз отмывали плату фосфатно-солевым буфером ивносили 100 мкл раствора конъюгата анти-кроличьих антител козла с пероксидазой хрена(A0545, Sigma-Aldrich, Германия) в концентрации 0,5 мкг/мл, ставили плату на мешалку на 1час при комнатной температуре. После этого пять раз отмывали плату фосфатно-солевымбуфером и три раза дистиллированной водой, вносили по 100 мкл/лунку раствора субстратапероксидазы хрена тетраметилбензидина (Thermo Fisher Scientific, США) и убирали плату втёмное место.
Через 3-5 минут, ориентируясь на окраску калибровочных проб, останавливалиокрашивание добавлением 50 мкл 2 М серной кислоты. Сигнал считывали с помощью прибораVictor 2 (Wallac, США), измеряя поглощение раствором в лунках света при 450 нм.Концентрацию ИЛ-36РА в пробах рассчитывали по калибровочной кривой с учётомразбавления.483.13.Оценка биологической активности ИЛ-36РА in vitro с использованием тест-системы на основе клеточной линии А549Клетки линии А549+36 были созданы к.м.н. Петровым А.В., в дальнейшем он принималактивное участие в совместном с автором диссертации тестировании биологической активностиИЛ-36РА и теоретическом обобщении полученных выводов, за что автор приносит ему своюглубочайшую благодарность.3.13.1.Культивирование клеток А549+36Клетки А549+36 были получены в лаборатории ранее при трансфекции клетокэпителиоподобной карциномы легкого человека А549 плазмидой, несущей ген рецептора ИЛ36 человека.
Клетки единственного полученного таким образом клона А549+36R нарастили икриоконсервировали в FCS c 10% диметилсульфоксида (Sigma, США) в жидком азоте, считаясозданный банк клеток культурой нулевого пассажа. Для последующих экспериментов клеткиА549+36R размораживали и культивировали в среде DMEM/F12 с L-глутамином (Биолот,Россия) с добавлением 0.5 мкг/мл пуромицина и 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS)(HyClone, США), в пластиковых флаконах 25 см2 (Costar, США).
Культивирование проводили винкубаторе при +37 °С в атмосфере 5% СО2 в условиях абсолютной влажности. Процедурупересева проводили раз в 3-4 сутки. Для снятия клеток с поверхности сосуда использовалисмесь 0.25% раствора трипсина с раствором Версена (1 : 1). Концентрацию клетокподсчитывали в камере Горяева, жизнеспособность определяли по исключению трипановогосинего. Для тестирования биологической активности ИЛ-36РА клетки А549+36R использовалина 4-10 пассажах.3.13.2.Оценка биологической активности ИЛ-36РАСравнение активности образцов ИЛ-36РА, полученных из различных штаммовпродуцентов, проводили по их способности блокировать действие ИЛ-36g на рецептор ИЛ-36на поверхности клеток А549+36.
Клетки А549+36R рассевали в 96-луночную плату по 40000клеток на лунку в 100 мкл DMEM/F12 c 10% FCS. Через 24 часа среду заменяли на свежую (100мкл) и в 50 мкл свежей среды с 1% FCS вносили различные полученные нами рекомбинантныеИЛ-36РА человека или коммерческий ИЛ-36РА человека в качестве стандартного образца впоследовательных троекратных разведениях в диапазоне конечных концентраций от 3000 нг/млдо 4.1 нг/мл.
Каждое разведение было выполнено в 3 повторениях. Затем добавляли 50 мкл49свежей среды с 1% FCS ИЛ-36g до конечной концентрации ИЛ-36g в среде 10 нг/мл. Через 24часа отбирали супернатант, в котором методом ИФА определяли концентрацию ИЛ-8.3.13.3.Определение концентрации ИЛ-8 методом ИФАИммуноферментный анализ для определения количества интерлейкина-8 проводили спомощью иммуноферментной тест-системы для количественного определения интерлейкина-8человека (Цитокин, Россия) по инструкции изготовителя.
Супернатанты предварительноразводили в 5—50 раз для того, чтобы полученные оптические плотности попадали в линейныйучасток калибровочной кривой. Значения, полученные для супернатантов от образцовпараллелях, усредняли. Измерение оптической плотности проводилось на планшетномфотометре Victor2 (Wallac, США) при длине волны 450 нм.3.13.4.Расчет активности образцов ИЛ-36РАМетод расчёта биологической активности образцов ИЛ-36РА был разработан к.ф.-м.н.Вахрушевым А.В., за что автор приносит свою благодарность.Для каждого образца экспериментальные точки (di,ci), где ci – усредненное значениеконцентраций ИЛ-8, измеренных при заданной концентрации di ИЛ-36РА, аппроксимировалисьэкспоненциальной функцией вида c(d)=A0+A1exp(a1d), такой, что сумма квадратов отклоненийвсех экспериментальных значений ci от значений аппроксимирующей функции c(di)минимальна.Аппроксимациюпризнавалиудовлетворительной,есликоэффициентеёдетерминированности (r2) был больше 0.95. Коэффициент A0 функции c(d) соответствуетфоновой концентрации ИЛ-8.
Экспонента exp(a1d) описывает снижение концентрации ИЛ-8 нафоне 10 нг/мл ИЛ-36g в связи с увеличением концентрации ИЛ-36РА. Активность исследуемыхобразцов ИЛ-36РА определяли как отношение площади под кривой концентраций ИЛ-8 c(d)(интеграла exp(a1d) на интервале 0 ≤ d < , равным – A1/a1) исследуемого и стандартногообразцов.3.14.Искусственное окисление ИЛ-36РАДля искусственного окисления к 120 мкл образца ИЛ-36РА с концентрацией 5 мг/мл в 50мМ натрий-фосфатном буфере рН 6,0, полученному в результате хроматографической очисткии ультрафильтрации, добавляли 480 мкл 100 мМ натрий-цитратного буфера рН 4,4 и 6 либо 0,6мкл 30% перекиси водорода (до 0,3% либо 0,03%, соответственно).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
