Диссертация (1145685), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Перед работой проводили регенерацию сорбента, последовательнопромывая его пятью объёмами регенерирующего раствора (50 мМ трис-ацетат, pH 9,0), пятьюобъёмами 0,2M NaOH и пятью объёмами 20% этанола со скоростью 5 мл/мин. Затем дляуравновешивания сорбент промывали тремя объёмами сорбционного буферного раствора (50мМ трис-ацетат, pH 4,0).Сорбцию ИЛ-36РА проводили, пропуская через колонку осветленный лизат биомассыштамма-продуцента, в сорбционном буферном растворе (50 мМ трис-ацетат, pH 4,0). Отмывкунесвязавшихся веществ проводили, пропуская через колонку десять объёмов сорбционногобуферного раствора (50 мМ трис-ацетат, pH 4,0). Отмывку от ЛПС проводили сначала 10объёмами 1% раствором Triton X-114 в 50 мМ трис-ацетатном буфере, pH 4,0, затем отмывку отостаточных количеств Triton X-114 проводили 10 объёмами 1% раствора Tween-80 в 50 мМтрис-ацетатном буфере, pH 4,0, затем отмывку от остаточных количеств Tween-80 проводили10 объёмами обычного отмывочного раствора (50 мМ трис-ацетат, pH 4,0).
Элюцию ИЛ-36РАпроводили элюирующим буферным раствором (50 мМ трис-ацетат, pH 5,5). Получаемую при41этом фракцию использовали для дальнейшей очистки ИЛ-36РА. Колонку регенерировали, какописано выше.3.5.3. Гидрофобная хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650SСорбент Toyopearl Butyl-650S (Tosoh, Япония) в количестве 20 мл помещали встеклянную колонку 25*200 мм (YMC, Германия) или в количестве 100 мл в колонку 50х200мм (YMC, Германия). Перед работой проводили регенерацию сорбента, последовательнопромывая его пятью объёмами 20% этанола со скоростью 10 мл/мин в случае малой колонки и20 мл/мин в случае большой колонки.
Затем для уравновешивания сорбент промывали тремяобъёмами отмывочного буферного раствора (50 мМ фосфат натрия, 150 мМ сульфата аммония,pH 6,0).К пробе, полученной на предыдущем этапе очистки, будь то анионообменнаяхроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США) или катионообменнаяхроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow (GE, США), добавляли сульфат аммония до150 мМ, перемешивали на магнитной мешалке до растворения сульфата аммония.Сорбцию ИЛ-36РА проводили, пропуская через колонку полученный раствор.
Отмывкунесвязавшихся веществ проводили, пропуская через колонку десять объёмов отмывочногобуферного раствора (50 мМ фосфат натрия, 150 мМ сульфата аммония, pH 6,0). В случае малойколонки элюцию ИЛ-36РА проводили апирогенной водой, отсекая концы выходящего пика. Кполученному таким образом образцу добавляли одну десятую объёма стабилизирующегобуферного раствора (0,5М цитрат натрия, рН 6,0). В случае большой колонки элюцию ИЛ-36РАпроводили элюирующим буферным раствором (50 мМ фосфат натрия, pH 6,0), отсекая концывыходящего пика.3.5.4.
Аффинная хроматография на сорбенте с иммобилизованными антителами кИЛ-36РАМетоды аффинной хроматографии были освоены под руководством Родина С.В.,антитела к ИЛ-36РА были получены к.б.н. Синевой С.А. с использованием предоставленныхавтором образцов, за что автор приносит свою искреннюю благодарность.3.5.4.1.Иммобилизация антител на сорбентеМоноклональные антитела к ИЛ-36РА человека были получены в лаборатории ранее.Образец антител для сорбции диализовали против сорбционного буфера (0,1 М NaHCO3, 0,5 M42NaCl pH 8,3). Сорбент заливали холодным отмывочным буфером (1 мМ HCl) и взбалтывали впробирке, пока он не обводнится. Затем сорбент помещали в воронку с фильтром,подключенную к вакуумному насосу.
Отмывали сорбент в воронке 10 объёмами отмывочногобуфера и 10 объёмами сорбционного буфера. Затем сорбент переносили из воронки в пробиркус образцом, перемешивали взбалтыванием и дегазировали. После этого пробирку оставлялимешаться на ночь на ротационной качалке при комнатной температуре. На следующий деньоценивали эффективность сорбции по концентрации белка в жидкости в пробирке с сорбентом.Если эффективность сорбции была достаточна, то блокировали сорбент добавлением растворатрис-HCl рН 8,0 до 0,1 М и оставляли перемешиваться на 2 часа на ротационнай качалке.
Передпервым применением сорбент отмывали 2 раза поочередно 5 объёмами 100 мМ глициновосолянокислого буфера рН 2,5 и 100 мМ трис-HCl буфера рН 9,0 с 0,5 М NaCl. После этогосорбент считали готовым к работе.3.5.4.2.Аффинная хроматографияСозданный, как описано выше, сорбент в количестве 5 мл помещали в пластиковуюколонку 10х100 мм (Bio-Rad, США). Перед работой проводили регенерацию сорбента,последовательно промывая его пятью объёмами 100 мМ глициново-солянокислого буфера рН2,5 со скоростью 4 мл/мин.
Затем для уравновешивания сорбент промывали пятью объёмамифосфатно-солевого буфера рН 7,2-7,4.Для выделения ИЛ-36РА этим способом 0,25-0,5 г биомассы штамма-продуцентализировали однократным замораживанием и размораживанием, затем ресуспендировали в 10мл фосфатно-солевого буфера рН 7,2-7,4, перемешивали в течение 30 минут, затем осветлялицентрифугированием при 20000 g в течение 30 минут. Перед нанесением на сорбент растворфильтровали через шприцевой фильтр с пористостью 0,22 мкм Millex (Merck-Millipore, США).Сорбцию ИЛ-36РА проводили, пропуская через колонку полученный раствор. Отмывкунесвязавшихся веществ проводили, пропуская через колонку десять объёмов фосфатносолевого буфера рН 7,2-7,4. Элюцию ИЛ-36РА проводили 100 мМ глициново-солянокислымбуфером рН 2,5. К полученному таким образом образцу добавляли одну десятую объёманейтрализующего буферного раствора (2 М трис-HCl, рН 8,0).433.6.
Ультрафильтрационное концентрирование раствора ИЛ-36РАИспользованный в настоящей работе метод ультрафильтрационного концентрированиябелков был освоен под руководством Полоцкого Е.А., за что автор приносит своюблагодарность.Перед работой ультрафильтрационную ячейку Amicon 8200 (Merck-Millipore, США) сустановленной мембраной Ultracel PL-10 (Merck-Millipore, США) отмывали водой дляинъекций дважды. Затем в ячейку для ультрафильтрации наливали 50 мл буферного раствора(50 мМ фосфат натрия, pH 6,0 или 50 мМ цитрат натрия, pH 6,0).
Ячейку устанавливали намагнитную мешалку, включали перемешивание на скорости 200 об/мин, затем ячейкуподключают к баллону со сжатым азотом через редуктор и подавали газ до давления 3атмосферы. Таким образом, через ячейку прокачивали 30 мл буферного раствора (50 мМфосфат натрия, pH 6,0 или 50 мМ цитрат натрия, pH 6,0) для уравновешивания мембраны.Остатки буферного раствора сливали.Раствор ИЛ-36РА, полученный в результате элюции с колонки с сорбентом ToyopearlButyl-650S (Tosoh, Япония), вносили в ультрафильтрационную ячейку Amicon 8200 (MerckMillipore, США), подключали её, как описано выше и выдерживали таким образом, пока объёмраствора в ячейке не достигнет расчётного.
Расчётный объём определяли по пропорции такомобразом, чтобы сконцентрировать образец до концентрации ИЛ-36РА не менее, чем 10 мг/мл,но не более, чем до 15 мг/мл. После этого отключали подачу газа, выравнивали давление вячейке с атмосферным и оставляли ячейку на магнитной мешалке на 10 минут. Затемполученный раствор, содержащий ИЛ-36РА, отбирали из ячейки.После произведённых работ ячейку для ультрафильтрации дважды промывали водой,затем в неё вносили 50 мл 0,1 М раствора NaOH в воде и прокачивали через неё 25 мл этогораствора для регенерации мембраны. Ячейку оставляли залитой этим раствором на ночь.
С утраостатки регенерирующего раствора сливали и мыли ячейку водой для инъекций 2 раза, затемпрокачивали через ячейку 30 мл воды для инъекций. Затем вносили в ячейку 50 мл 20%раствора этанола в воде для инъекций и прокачивали через неё 25 мл этого раствора дляконсервации мембраны для хранения. Хранили ячейку наполненной 20% раствором этанола вводе при +4 °С.443.7. Диск-электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрияВ проведении экспериментов по анализу образцов, предоставленных автором, методомдиск-электрофореза принимали техническое участие Калинин Р.С.
и Ёлшин Н.В., за что авторприносит свою благодарность.Электрофорез белков проводили системе из концентрирующего 4% полиакриламидногогеля (ПААГ) и 12% разделяющего в аппарате Mini-PROTEAN IV (Bio-Rad, США) сиспользованием электродного буфера (0,25 M трис pH 8,3, 0,192 М глицин, 0,1%додецилсульфат натрия).
Для приготовления концентрирующег геля использовался буфер 0,5 Mтрис-HCl pH 6,8, для разделяющего 1,5 M трис-HCl pH 8,8.Перед внесением образцов в гель к ним добавлялась ¼ объёма буфера для внесенияобразцов (0,2% бромфенолового синего, 8% SDS, 20% глицерина, 240 мМ трис-HCl pH 6,8, 10%β-меркаптоэтанола или без него).
Затем образцы нагревали до +95 °С в течение 5 минут, затемвносили в гель. Электрофорез белков проводили при напряжении 180 В, силе тока 130 мА довыхода красителя из геля.3.8. Вестерн блот для определения ИЛ-36РАВ проведении экспериментов по методу вестерн-блоттинга с использованием образцов,предоставленных автором, принимал участие Ёлшин Н.В., за что автор приносит своюблагодарность.По завершении электрофореза проводили электроперенос белков из полиактиламидногогеля на нитроцеллюлозную мембрану с использованием аппаратаMini-TransBlot (Bio-Rad,США).
Собирали кассету для переноса. Для этого прикладывали гель и мембрану друг к другу,помещали их между слоями плотной бумаги и губчатой подложки. Полученную конструкциюпомещали в специальную кассету, закрывали её и вставляли в камеру для электропереноса.Перенос проводили в электродном буфере (25 мМ трис, 192 мМ глицин, pH 8,3) в течение 1часа при напряжении 180 В. После переноса мембрану блокировали в течение 1 часа вфосфатно-солевом буфере рН 7,2-7,4 с 2% бычьего сывороточного альбумина. После этогомембрану отмывали и погружали в раствор моноклональных мышиных антител к ИЛ-36РАчеловека (MAB1275, R&D Systems, США) с концентрацией 5 мкг/мл в фосфатно-солевомбуфере с 0,05% Tween-20 и инкубировали 1 час. Затем мембрану отмывали 5 раз фосфатносолевым буфером рН 7,2-7,4 с 0,05% Tween-20. Затем мембрану помещали в раствор45поликлональных козьих антител, специфичных к Fc-фрагментам антител мышей, меченыхпероксидазой хрена (A4416, Sigma-Aldrich, Германия) в концентрации 5 мкг/мл, в фосфатносолевом буфере рН 7,2-7,4 с 0,05% Tween-20, инкубировали 1 час.
После инкубации отмывкуповторяли. Окрашивание производили в фосфатно-солевом буфере с 0,01% диаминобензидинагидрохлорида (Sigma-Aldrich, Германия) и 0,3% перекиси водорода до появления окраскибелковых бендов.3.9. Очистка растворов от ЛПС с помощью обработки Triton X-114ДляочисткиполучаемогораствораИЛ-36РАотпримесиЛПСприменялимодифицированный метод разделения раствора на несмешиваемые фазы с использованиемдетергента Triton X-114. К образцу ИЛ36-РА в апирогенной пробирке добавляли стоковый 10%раствор Triton X-114 из расчёта 25 мкл раствора на 1 мл образца и перемешивалипипетированием или аккуратным взбалтыванием в закрытой пробирке.
Затем образецинкубировали 30 минут на ледяной бане, 5-15 минут в водном термостате при температуре +30°С до помутнения раствора. Фракцию мицелл Triton X-114, содержащую ЛПС, отделялицентрифугированием при 3000 g в течение 10 минут. Верхнюю водную фазу переносили вчистую апирогенную емкость. Протокол повторяли 2 раза.После обработки примесь Triton X-114 остаётся в верхней водной фазе в концентрацииниже или примерной равной его критической концентрации мицеллообразования - 0,2 мМ(~165 мкг/мл). Эта остаточная примесь Triton X-114 может быть удалена с помощью диализа пометодике, описанной ниже.3.10.Очистка растворов от Triton X-114 с помощью диализаОчистку растворов ИЛ-36РА от Triton X-114 проводили с помощью диализа противбуферного раствора, содержащего 50 мМ цитрат натрия, рН 6,0.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
