Диссертация (1145685), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Схема плазмиды pET-IL36Raf приведена на Рисунок 6.55pETIL36RafРисунок 6. Схема плазмиды pET-IL36Raf.Lac I – Ген Lac-репрессора; Lac operon –промотор Lac-оперона;T7 promotor – промотор гена 10 фагаТ7; IL-36Raf – генIL36RNчеловека(кодирует ИЛ-36РА); T7 terminator – терминатор транскрипции РНК-полимеразы фагаТ7;Amp(R) – ген бета-лактамазы; pBR322 origin – ориджин репликации плазмиды pBR322; NdeIи XhoI – сайты рестрикции, ограничивающие ген IL36RN.Идентичность последовательности гена получаемого ИЛ-36РА человека природнойпоследовательности (UniGene, Ref Seq NM_012275.2) установили методом секвенированияДНК плазмиды.
Идентичность аминокислотной последовательности полученного ИЛ-36РАпоследовательности сравнения (UniProt Q9UBH0 [178]) была подтверждена методом MALDITOF масс-спектрометрии. Покрытие последовательности ИЛ-36РА в результате МС-анализасоставило 69% (Рисунок 7). Достаточно низкая степень покрытия объясняется наличием впоследовательности ИЛ-36РА участка, лишенного сайтов протеолиза трипсина. Пептид,образующийся из этого фрагмента ИЛ-36РА в результате гидролиза трипсином, слишком великдляэффективногоанализа.Однакополученныхданныхоказалосьдостаточнодляподтверждения идентичности белка.
В дальнейшем основными критериями идентичностиполучаемого ИЛ-36РА считали совпадение времен выхода в ОФ-ВЭЖХ пика образца истандартного образца, исследованного методом масс-спектрометрии, а также данных тестабиологической активности (см. далее).561 MVLSGALCFR MKDSALKVLY LHNNQLLAGG LHAGKVIKGE EISVVPNRWL51 DASLSPVILG VQGGSQCLSC GVGQEPTLTL EPVNIMELYL GAKESKSFTF101 YRRDMGLTSS FESAAYPGWF LCTVPEADQP VRLTQLPENG GWNAPITDFY151 FQQCDРисунок 7.
Последовательность рекомбинантного ИЛ-36РА человека, детектированныеметодом масс-спектрометрии пептиды отмечены жирным красным.Установлено, что ИЛ-36РА, получаемый от штамма-продуцента E.coli BL21[DE3](pETIL36Raf), содержит примесь непроцессированной формы с неотщеплённым N-концевыминициаторным остатком метионина (далее - метиониновая форма). Был предложен иапробирован метод количественного определения примеси этой формы с помощью ОФ-ВЭЖХ.То, что этим методом определяется именно метиониновая форма ИЛ-36РА, подтвержденообработкой образца ИЛ-36РА рекомбинантной метионинаминпептидазой 2 человеа (R&DSystems, США) (Рисунок 8). После такой обработки образец становится гомогенным.Рисунок 8.
Наложение хроматограмм ОФ-ВЭЖХ разделения образца ИЛ-36РА отпродуцентаE.coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)доипослеобработкиinvitroметионинаминопептидазой 2 (МАП2) человека (R&D Systems, США).Недостаточно эффективное отщепление инициаторного остатка формилметионина с Nконца – распространённая проблема для рекомбинантных белков, получаемых в бактериальных57продуцентах [57, 106, 169, 173]. В ряде случаев такие белки обладают существенно сниженнойбиологической активностью [106, 169]. Эта проблема характерна и для ИЛ-36РА. Известно, чтометиониновая форма ИЛ-36РА обладает существенно меньшей биологической активностью,чем его процессированная форма (11).
В связи с этим возникла необходимость разработкиспособа получения процессированного безметионинового ИЛ-36РА.В E. coli отщепление инициаторного N-концевого остатка формилметионина требуетработы двух ферментов: деформилазы и метионинаминопептидазы (МАП). Первый ферментотщепляет формильную группу, второй отщепляет остаток метионина [89, 124]. Процессдеформилирования тесно связан с процессом трансляции, т.к. деформилаза связана с рибосомой[104].
В литературе нам не удалось найти данных о том, чтобы недостаток активностидеформилазы служил ограничением продукции экзогенных рекомбинантных белков в E. coli. Вто же время представлено множество таких данных в отношении метионинаминопептидазы [57,106, 169, 173].Эффективностьотщепленияостаткаметионинаотпродуцируемогобелкаметионинаминопептидазой напрямую зависит от следующего за метионином аминокислотногоостатка [41, 162].
Процессинг идёт тем эффективнее, чем меньше боковой радикал второйаминокислоты в цепи, и может быть существенно замедлен в случае аминокислот с большимибоковыми радикалами, таких как триптофан [12, 31, 162].Это определяет принципиальную невозможность применения МАП к некоторымобъектам. В таких случаях решением проблемы становится введение сайта распознаваниякакой-либо протеазы с N-конца получаемого белка и последующая обработка продукта этойпротеазой in vitro [120] или in vivo [107]. Метионин в таком случае отщепляется вместе снесколькими аминокислотами, входящими в сайт распознавания протеазы.Однако использование МАП представляется наиболее экономичным подходом.
Приэтом обработка продукта выделенной и очищенной МАП in vitro нежелательна, т.к.значительно усложняет технологический процесс. Поэтому оптимальным вариантом являетсякоэкспрессия рекомбинантного белка с МАП. В этом случае система коэкспрессии требуетзначительной оптимизации, т.к. продукция МАП сама по себе создаёт метаболическуюнагрузку на клетку, что понижает выход целевого продукта.В качестве штамма-продуцента был выбран штамм E.coli BL21 Star [DE3] (Invitrogen,США), для которого характерны возможность использования промоторов генов фага Т7 дляконтроля экспрессии гена рекомбинантного белка, замедленная деградация мРНК внутри58клетки вследствие деактивации гена РНКазы Е (rne131) [51] и меньший шанс протеолитическойдеградации продукта из-за деактивации протеаз lon и OmpT.Для выбора оптимальных условий коэкспрессии генов ИЛ-36РА и МАП в клетках E.coliBL21 Star[DE3] была создана серия штаммов-продуцентов ИЛ-36РА, трансформированныхдвумя плазмидами: ранее созданной pET-IL36Raf и плазмидой, несущей ген МАП E.coli.
Схемас двумя плазмидами сделала возможным быстрое и простое тестирование разнообразныхусловий коэкспресии. Кроме того, полученные плазмиды можно применять и для работы сиными объектами.Для сосуществования без конкуренции за средства репликации плазмиды должныотноситься к различным группам несовместимости, т.е. иметь различные ориджинырепликации, работающие по разным механизмам. Плазмида pET-IL36Raf содержит ориджинрепликации рМВ1. Поэтому за основу для вектора, несущего ген МАП, была взята плазмидаpACYC184, несущая ориджин репликации р15А.Создана серия плазмид, несущих ген МАП под контролем промоторов различной силы:T7/lac, активируемого ИПТГ или лактозой; rhaBAD, активируемого рамнозой; araBAD,активируемого арабинозой.
Плазмиды получили названия pET15A, pBAD15A и pRh15A,соответственно(Рисунок9,10,11).ДалееимииплазмидойpET-IL36Rafбылитрансформированы бактерии штамма E.coli BL21 Star [DE3]. Штаммы получили названия E.coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A),E.coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A)иE.coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A), соответственно. Процесс создания плазмид, несущих генМАП, и штаммов-продуцентов изложен в разделе «Материалы и методы».59Рисунок9.СхемыплазмидыpET15A.MAP–последовательностьгенаметионинаминопептидазы E.
coli; T7 promoter – промотор гена 10 фага Т7; T7 terminator –терминатор транскрипции генов фага Т7; lacI – последовательность гена lacI, регулирующегоэкспрессию генов, находящихся под контролем промотора T7; p15A origin – сайт началарепликации плазмид; CamR – последовательность гена хлорамфениколацетилтрансферазы,обеспечивающей устойчивость бактерий к хлорамфениколу; EcoRI, BamHI, HindIII, SalI –рестрикционные сайты, необходимые для объединения отдельных фрагментов в векторе.60Рисунок 10. Схемы плазмиды pBAD15A. MAP – ген метионинаминопептидазы E.
coli;pBADara promoter – активируемый арабинозой промотор pBADara; rrnB T1T2 terminators –терминаторы транскрипции гена rrnB E.coli; araBAD operon – регуляторная последовательностьaraBAD оперона, необходимая для регуляции экспрессии генов, находящихся под контролемпромотораpBADara;p15Aorigin–сайтначаларепликацииплазмид;CamR–последовательность гена хлорамфениколацетилтрансферазы, обеспечивающей устойчивостьбактерий к хлорамфениколу; SalI, HindIII, XhoI, NdeI – рестрикционные сайты, необходимыедля объединения отдельных фрагментов в векторе.61Рисунок 11. Схемы плазмиды pRh15A. MAP – ген метионинаминопептидазы E.
coli;rhaBAD promoter – активируемый рамнозой промотор rhaBAD; T7 terminator –терминатортранскрипции генов фага Т7; rhaBAD operon – регуляторная последовательность rhaBADоперона, необходимая для регуляции экспрессии генов, находящихся под контролем промотораrhaBAD; p15A origin – сайт начала репликации плазмид; CamR – последовательность генахлорамфениколацетилтрансферазы,обеспечивающейустойчивостьбактерийкхлорамфениколу; SalI, HindIII, XhoI, NdeI – рестрикционные сайты, необходимые дляобъединения отдельных фрагментов в векторе.Таким образом, были получены три штамма-продуцента безметионинового ИЛ-36РА.Следующим этапом работы стала оптимизация условий индукции совместной экспресии генов,кодирующих МАП и ИЛ-36РА.4.1.2. Оптимизация условий индукции экспрессии гена ИЛ-36РА штаммамипродуцентами безметионинового ИЛ-36РАРанее были установлены оптимальные условия синтеза ИЛ-36РА штаммом-продуцентомE.
coli BL21 [DE3] (pET-IL36Raf), а именно – доза индуктора (0,5 мМ IPTG) ипродолжительность индукции (3 часа). Основная доля целевого белка находилась вцитоплазматической фракции. От этих значений отталкивались при выборе оптимальныхусловий индукции параллельной экспрессии генов ИЛ-36РА и МАП двухплазмидными62штаммами. Для каждого из штаммов сначала определили оптимальную концентрациюиндуктора экспрессии гена МАП (Рисунок 12, 13, 14).Так, для штамма с МАП под контролем активируемого рамнозой промотора приэлектрофоретическоманализелизатовбиомассынаблюдалипостепенноеувеличениеинтенсивности полосы, соответствующей по массе МАР, в зависимости от продолжительностииндукции (от 1 до 4 часов), однако существенных различий в зависимости от использованнойконцентрации рамнозы выявлено не было (Рисунок 12).
Таким образом, оптимальнаяконцентрация рамнозы составила 0,1%, а время индукции 2,5-3 часа – при этих условияхпродукция ИЛ-36РА была максимальна.1234567891011Рисунок 12. Электрофореграмма лизатов биомассы штамма E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf)(pRh15A) после индукции экспресии гена МАП в различных условиях. Тонкой чернойстрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной массе МАР (31 кДа). Толстойсиней стрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной массе ИЛ-36РА (16,8кДа).Дорожки: 1 – лизат культуры без индукции; 2 - маркеры молекулярных весов, кДа; 3, 4, 9 –0,1% рамнозы; 5, 6, 10 – 0,25% рамнозы; 7, 8, 11 – 0,5% рамнозы; 3, 6, 8 – 1 час; 4, 5, 7 – 2,5часа; 9, 10, 11 – 4 часа.При электрофоретическом анализе лизатов биомассы штамма с МАП под контролемактивируемого ИПТГ промотора наблюдали значительное увеличение интенсивности полосы,соответствующей по массе МАР, в зависимости от концентрации ИПТГ при стандартном63времени индукции 3 часа (Рисунок 13).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
