Диссертация (1145685), страница 15
Текст из файла (страница 15)
При этомсодержание ИЛ-36РА в культуре составило 5 мкг/ОЕ культуры.Рисунок 23. Общее количество продуцируемого культурой ИЛ-36РА в зависимости отвременикультивированияштамма-продуцентаИЛ-36РАE.coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A). Эксперимент по отработке времени культивированияв 1-литровомбиореакторе - культивирование в течение 5 часов после индукции.Культивирование штамма-продуцента без понижения температуры было опробировано вследующей серии экспериментов.
Отбор проб для оценки динамики наработки ИЛ-36РАкультурой проводили один раз в полчаса или час. Установлено,что пик наработки ИЛ-36РАприходится на 2 часа после индукции,после чего количество белка падает, вероятно, врезультате потребления его самой культурой (Рисунок 24А). Таким образом, при такой схемекультивирования оптимальное время индукции - 2 часа.
Продуцируемый ИЛ-36РА содержалменее 5% непроцессированной формы. Однако воспроизводимость данного результатаоказалась низкой. При последующих культивированиях по этой схеме момент начала паденияконцентрации ИЛ-36РА мог быть сдвинут к началу культивирования, что приводило кзакономерному снижению выхода продукта (Рисунок 24Б). Поэтому была выбрана схема сизменением температуры, как более надежная.77Рисунок 24. Общее количество продуцируемого культурой ИЛ-36РА в зависимости отвременикультивированияштамма-продуцентаИЛ-36РАE.coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A).
Эксперименты по отработке времени культивированияв 1-литровомбиореаторе без понижения температуры: А – культивирование в течение 3 часов послеиндукции, Б – культивирование в течение 2 часов после индукции.Учитывая, что прежде при отработке условий культивирования в колбах былиподобраныминимальныеэффективныеконцентрациииндукторов,апривсехкультивированиях в 1-литровом биореакторе ИЛ-36РА нарабатывался вполне эффективно исодержал менее 5% непроцессированной формы, концентрации индукторов было решено неменять.Разработанный протокол культивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА в 1-литровомбиореакторе был опробован в условиях 10-литрового биореактора. Динамика роста культуры инаработки ИЛ-36РА в целом были аналогичны культивированию в малом сосуде биореактора.Из-за того, что в 10-литровом сосуде удалось доращивать культуру до большей плотности,наблюдалось увеличение продукции ИЛ-36РА (Рисунок 25).
Однако продукция ИЛ-36РАотдельной бактериальной клеткой сохранялась примерно на том же уровне и составляла всреднем 6 мкг/ОЕ.78Рисунок 25.Общее количество продуцируемого культурой ИЛ-36РА в зависимости отвременикультивированияштамма-продуцентаИЛ-36РАE.coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) в 10-литровом биореаторе. Средние значения от трёх последовательныхкультивирований, вертикальные планки обозначают SD.При первых культивированиях не удавалось добиться эффективной работы МАПполучаемыйИЛ-36РАсодержал30-50%непроцессированной–формы. Эффективностьнаработки ИЛ-36РА не изменялась.
Внесение дополнительных 0,8 г/л арабинозы 1 раз в часпозволило снизить содержание непроцессированной формы в получаемом ИЛ-36РА до 5%.Таким образом, разработан протокол культивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА вусловиях биореактора «BIOFLO-110» (NewBrunswick, США) и проведено масштабированиекультивирования в реакторе в 10 раз. При этом была отмечена способность культуры большегообъема метаболизировать арабинозу. Вероятно, это связано тем, что в культуре большегообъема могут быстрее отбираться клетки с такими метаболическими особенностями.
Припереходе к культивированию штамма-продуцента ИЛ-36РА в биореакторах объёмом 10 л мыполучили возможность нарабатывать в 30-50 раз больше ИЛ-36РА, по сравнению скультивированием в серии колб.Следующим шагом было культивирование штамма-продуцента в масштабах пилотногопроизводства в биореакторе объёмом 250 л (рабочий объём культуры 160 л) на базе ИнститутаБиохимии и Физиологии Микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук(ИБФМ РАН) под руководством Самойленко В.А..
Был применен разработанный протоколкультивирования, за исключением того, что сразу была использована 2-кратная среда LB безпоследующей питательной добавки. В этом случае был получен ИЛ-36РА с требуемымихарактеристиками и в 14-18 раз больших количествах, чем в 10 л биореакторе.794.2. Разработка методики хроматографической очистки ИЛ-36РА, исследованиефизико-химических свойств ИЛ-36РАХроматографическая очистка ИЛ-36РА была необходима на всех этапах работы отначальных его этапов до конечных, где ИЛ-36РА необходимо было получать в качестве иколичестве, необходимомдля проведения доклинических испытаний его активности итоксичности как лекарственного препарата.
Требования к качеству препарата, масштабынаработки и технические ограничения по мере развития проекта нарастали последовательно.Соответственно последовательно изменялась технология хроматографической очистки ИЛ36РА. Данный раздел описывает и объясняет эти последовательные изменения.4.2.1. Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в исследовательском масштабе,исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА4.2.1.1.Отработкаусловийлизисабиомассыштамма-продуцентавлабораторном масштабеНа начальном этапе проекта штамм-продуцент культивировали в нескольких колбах.Совокупный выход биомассы от одного культивирования составлял в среднем 5,2 г.
Посколькурекомбинантный ИЛ-36РА нарабатывается в клетках штамма-продуцента в растворимом виде,был осуществлен подбор условий лизиса биомассы количестве 5 г, обеспечивающихнаибольший выход белка в растворимой фракции. Помимо трехкратного замораживанияразмораживания добавлялибета-меркаптоэтанол до 0,1% или обрабатывали лизатультразвуком, который генерировали дезинтегратором VCX500 (Sonics, США).
СодержаниеИЛ-36РА в тотальном лизате, а также в его растворимой и нерастворимой фракцях оценивали спомощью электрофореза в ПААГ.Основная доля целевого белка с молекулярной массой около 18 кДа содержится врастворимой фракции (Рисунок 26). Обработка ультразвуком существенно увеличивала выходпримесных белков, но не влияла на выход ИЛ-36РА.Поскольку добавление бетамеркаптоэтанола не влияло на содержание ИЛ-36РА в лизате (Рисунок 26) и могло привести квосстановлению дисульфидных связей в ИЛ-36РА, от его применения при лизисе биомассырешили отказаться.80123456789101112МВ, кДаРисунок 26.
Электрофореграмма лизатов биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РАчеловека E.coli BL21[DE3](pET-IL36Raf). Дорожки: 1-4 – тотальные лизаты, 5-8 –нерастворимая фракция, 9-12 – растворимая фракция; 2, 4, 6, 8, 10, 12 – дополнительнаяобработка ультразвуком; 3, 4, 7, 8, 11, 12 – добавление 0,1% бета-меркаптоэтанола.Таким образом, оптимальным методом лизиса биомассы штамма-продуцента на этомэтапе оказалось трехкратное замораживание-размораживание и осветление с помощьюцентрифугирования.4.2.1.2.Хроматографическая очистка ИЛ-36РА в лабораторном масштабеМетод хроматографической очистки ИЛ-36РА подбирали, исходя из рассчитанных insilico физико-химических свойств (Рисунок 27).
В качестве первого шага очистки выбралианионообменную хроматографию с сорбцией белка на сорбент при рН 8,0.81Рисунок 27. Кривая титрования ИЛ-36РА. Рассчитана с помощьюThe Sequence Analyzer(Proteinchemist.com, США).Проведено сравнение двух анионообменных сорбентов – DEAE Sepharose Fast Flow (GE,США) и Q Sepharose Fast Flow (GE, США).
Колонки с сорбентами уравновешивали 10объемами буферного раствора 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0 (он же сорбционный, лизирующий иотмывающий буфер), наносили образец и отмывали колонку тем же буферным раствором додостижения базовой линии кривой поглощения ультрафиолета при длине волны 280 нм.Элюцию ИЛ-36РА проводили градиентом NaCl от 0 до 500 мМ в том же буферном растворе за30 объёмов колонки. Сбор пиков проводили вручную.В обоих случаях ИЛ-36РА элюировался в ответ на 0,10-0,15 М NaCl. При этом чистотаполученного препарата составляла около 50% после очистки на DEAE (Рисунок 28) и около60% после очистки на Q (Рисунок 29).821234576МВ, кДаРисунок 28.Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографическойочистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте DEAE Sepharose FastFlow (GE, США). Дорожки: 1 – исходный лизат, 2 – несвязавшаяся фракция, 3 – пик 1 (0-0,2 МNaCl), 4 – пик 2 (0,20-0,35 М NaCl), 5 – пик 3 (0,35-0,50 М NaCl), 6–регенерация 0,2 М NaOH, 7– промывка 20% этанолом.12345678910МВ, кДаРисунок 29.Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографическойочистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте Q Sepharose Fast Flow(GE, США).
Дорожки: 1 – исходный лизат, 2 – несвязавшаяся фракция, 3-7 – отмывкаотмывочным буфером, 8 – пик 1 (0-0,2 М NaCl), 9 – пик 2 (0,20-0,35 М NaCl), 10 – пик 3 (0,350,50 М NaCl).83Для дальнейшей очистки ИЛ-36РА использовали гидрофобную хроматографию насорбенте Butyl-650 S. К ИЛ-36РА-содержащему элюату с Q Sepharose Fast Flow добавляликристаллический сульфат аммония до 300 мМ и перемешивали до растворения.
Полученныйраствор наносили на колонку с Butyl-650 S, уравновешенную 50 мМ натрий-фосфатнымбуфером с 300 мМ сульфата аммония, pH 6,5 и промывали колонку 50 мМ натрий-фосфатнымбуфером с 50 мМ сульфата аммония, pH 6,5. Элюцию проводили градиентом отмывочногобуфера и воды. На электрофореграмме собранных фракций элюата в области, соответствующейИЛ-36РА, виден второй бенд (Рисунок 30).МВ, кДа12345678910 12 13116664535251814Рисунок 30. Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографическойочистки ИЛ-36РА на сорбенте Butyl-650S.
Дорожки: 1 – исходный образец (элюат с QSephararose Fast Flow), 2 – несвязавшаяся фракция, 3– отмывка отмывочным буфером, 4-13–последовательно собранные фракции элюата.Полученные фракции ИЛ-36А были объединены и проанализированы методом ОФВЭЖХ. Анализ показал, что образец содержит высоочищенный ИЛ-36РА (Рисунок 31).
Этопозволило предположить, что второй бенд, на элетрофореграмме - это модифицированная илиподвергшейся частичному протеолизу форма ИЛ-36РА.84Рисунок 31. ОФ-ВЭЖХ хроматограмма ИЛ-36РА после хроматографической очистки насорбенте Butyl-650S (Tosoh, Япония).Также был отработан процесс ультрафильтрационного концентрирования ИЛ-36РА сиспользованием ячейки Amicon 8200 (Merck-Millipore, США) с мембраной Ultracel PL-10(Merck-Millipore, США). Процесс шёл без потерь до достижения концентрации белка 15 мг/мл,после чего начиналась агрегация ИЛ-36РА. Эта стадия технологического цикла получения ИЛ36РА в дальнейшем не претерпела никаких существенных изменений.Таким образом, разработан метод неаффинной хроматографической очистки ИЛ-36РА излизата биомассы штамма-продуцента с применением анионообменной хроматографии насорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США) и гидрофобной хроматографии на сорбенте Butyl650S (Tosoh, Япония).4.2.1.3.Изучение гетерогенности ИЛ-36РАКак указывалось выше, на электрофореграмме фракций, полученных при элюции ИЛ36РА с сорбента Butyl-650S, наблюдается наличие второго бенда в области, соответствующейИЛ-36РА.
Для установления природы примесного продукта полученный образец ИЛ-36РАразделилиэлектрофоретическивполиакриламидномгелевысокойплотностиввосстанавливающих и невосстанавливающих условиях (Рисунок 32), а затем анализировали85методом вестерн-блота с моноклональными антителами к ИЛ-36РА человека (1275-IL, R&DSysytems, США) (Рисунок 33).12МВ, кДа34Рисунок 32. Электрофореграмма элюата после хроматографической очистки ИЛ-36РА насорбенте Butyl-650 S в невосстанавливающих (дорожки 1,2) и восстанавливающих (дорожки3,4) условиях. На дорожки 2 и 4 нанесено вдвое большее количество образца.12МВ, кДа34Рисунок 33. Вестерн-блот анализ с моноклональными антителами к ИЛ-36РА человека(1275-IL, R&D Sysytems, США) элюата после хроматографической очистки ИЛ-36РА насорбенте Butyl-650 S в невосстанавливающих (дорожки 3,4) и восстанавливающих (дорожки1,2) условиях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
