Диссертация (1145685), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Этот менее мобильный («верхний») бенд соответствовал дезамидированной форме ИЛ36РА (Рисунок 43).123МВ, кДаРисунок 43. Электрофореграмма образцов ИЛ-36РА, содержащих разное количествопримеси дезамидированной формы белка: 1 – 1,3%, 2 – 5%, 3 – 43%.93Таким образом, электрофорез в ПААГ может быть использован для ориентировочногоконтроля содержания дезамидированной формы ИЛ-36РА на разных этапах производственногопроцесса. Для количественного анализа дезамидирования этот метод непригоден, посколькупробоподготовка белка перед проведением электрофореза, включающая нагрев в щелочномбуфере, может индуцировать дезамидирование.Дезамидирование ИЛ-36РА не влияло на его биологическую активность: белок,содержащий около 1% дезамидированной формы, имел такую же активность, как ИЛ-36РА,дезамидированный более чем на 40%. Вероятно, дезамидирование Asn-139 не влияет навзаимодействие ИЛ-36РА с рецептором.Несмотря на то, что дезамидированиеAsn-139 в молекуле ИЛ-36РА не влияет напрямуюна биологическую активность, оно всё же является нежелательной модификацией, которойследует избегать.
Показано, что дезамидирование остатков аспарагина, как правило,дестабилизирует пространственную структуру белка [140] и особенно ярко это проявляется прихранении препаратов.4.2.1.4.Оптимизация условий хранения ИЛ-36РАПоскольку лиофильное высушивание белков часто провоцирует окисление и агрегациюбелка, в том числе, за счет образования межмолекулярных дисульфидных связей [147],фармацевтическую субстанцию ИЛ-36РА приготовили в виде раствора. В ходе проведенныхэкспериментов были оптимизированы такие параметры, как рН раствора и концентрацияактивного фармацевтического ингредиента.При снижении рН раствора белка ниже 5,5 наблюдалась интенсивная агрегация белка,что было ожидаемо ввиду того, что изоэлектрическая точка ИЛ-36РА составляет 5,2.
Признакиагрегации не наблюдались при хранении ИЛ-36РА в водно-солевых буферах при рН 7,4 вконцентрации менее 10 мг/мл в течение нескольких месяцев, однако при повышенииконцентрации белка выше 15 мг/мл происходила интенсивная агрегация с выпадением в осадокосновной части рекомбинантного ИЛ-36РА. Также при хранении ИЛ-36РА при рН 7,4происходило его дезамидирование.Согласно литературным данным на процесс дезамидирования влияют рН раствора,содержание солей и ионов двухвалентных металлов [99, 141, 147][141]. Поэтому нами былосуществлен подбор вариантов растворов с низкими значениями рН, минимальнойконцентрацией солей и ионов металлов.94Учитывая, что в растворах с рН близким к значениям pI растворенных в них белковчасто происходит агрегация последних, и что при рН > 7,0 ИЛ-36-РА склонен кдезамидированию, в качестве оптимального для хранения диапазона рН был выбран 6,0 – 6,5.
Вэтой области рН в качестве буферов для фармацевтических композиций чаще всегоиспользуются фосфатный и цитратный буферы. Однако, цитратный буфер более пригоден дляподдержания стабильного значения рН в этой области, чем фосфатный, поэтому в качествебазовой буферной системы был выбран 50 мМ цитратный буфер без добавления других солейдля сохранения слабой гипоосмолярности.В качестве второго стабилизирующего компонента для ФС рассматривался неионныйдетергент полисорбат-80 (Tween-80). Наряду с полисорбатом-20 (Tween-20), это соединениеявляется одним из наиболее широко используемых вспомогательных веществ в композицияхбиофармацевтических препаратов.
Полисорбаты представляют собой смесь близких поструктуре эфиров жирных кислот полиоксиэтилен-сорбитангидрида. Основными жирнымикислотами являются лауриновая и олеиновая, составляющие до 60% остатков [65].Главным назначение полисорбатов в растворах ФС и ГЛФ является предотвращениеадсорбции рекомбинантных белков из растворов низких концентраций на стенки первичнойупаковки. Для субстанции ИЛ-36РА, где концентрация белка составляет 10 мг/мл, эта проблемапрактически неактуальна, поскольку потери из-за адсорбции могут составлять лишь долипроцента. Другое назначение полисорбата, особенно в концентрированных растворах белков –предотвращение аггрегации белка. Механизм этого действия полисорбатов связан с блокадойгидрофобных взаимодействий между отдельными молекулами полипептидов, а также междубелком и поверхностью первичной упаковки [147].
Это особенно важно для гидрофобныхбелков, таких как ИЛ-36РА.Однако известно, что высокие концентрации полисорбата могут провоцироватьагрегацию некоторых белков при повышенных температурах [144]. В связи с этим для ФС ИЛ36РА изучали стабильность при добавлении полисорбата-80 в диапазоне концентраций от0,01% до 0,1%.Третьим компонентом, который был введен в состав ФС ИЛ-36РА, стал ЭДТА. Являясьхелатором ионов двухвалентных металлов, ЭДТА частично блокирует реакции окислениярекомбинантных белков. Натриевая соль ЭДТА добавляется в состав жидких форм ФС обычнов стандартной концентрации 1 мМ [147].Были приготовлены растворы ИЛ-36РА трех составов:951.50 мМ цитратный буфер (рН 6,0).2.50 мМ цитратный буфер (рН 6,0), полисорбат-80 (0,1%)3.50 мМ цитратный буфер (рН 6,0), полисорбат-80 (0,1%), эдетат натрия 1 мМ.Было изготовлено три опытных партии ФС ИЛ-36РА с концентрацией ИЛ-36РА 10 мг/млс вариантами состава раствора, как описано выше.Для предварительного анализа стабильности проведено изучение термостабильностиФС в исследуемых композициях методом динамического светорассеяния (ДСР).
Метод основанна измерении размера частиц в растворе при последовательном нагреве образца. Посколькунаиболее критическим параметром для предотвращения агрегации ИЛ-36РА представлялосьналичие 0,1% полисорбата-80, сравнивали образцы ФС, имеющие его в своём составе и неимеющие.При ДСР-исследовании значимых различий между двумя образцами ФС в динамикеагрегации при нагреве не было обнаружено. В обоих образцах при нагревании от +30 °С до +35°С наблюдалось медленное увеличение размеров частиц (Рисунок 44).
При нагреве до +40 °С вобоих образцах наблюдалось одинаковое увеличение размеров агрегатов в среднем до 5 нм(Рисунок 44), а при дальнейшем нагреве – лавинообразная агрегация и резкое увеличениеразмерачастицвобоихисследованныхобразцах(Рисунок44).Такимобразом,предварительный анализ агрегационной стабильности ФС ИЛ-36РА методом ДСР не позволилоднозначно подтвердить или опровергнуть эффективность присутствия полисорбата-80 всоставе композиции.Исследование стабильности продолжили с использованием традиционного подхода схранением образцов при температуре + 4-8 °С.
Биологическую активность ИЛ-36РАтестировали в модельной системе in vitro, наличие агрегатов ИЛ-36РА - методом ГП-ВЭЖХ,окисление ИЛ-36РА - методом ОФ-ВЭЖХ, дезамидирование ИЛ-36РА - методом кИЭФ,концентрацию ИЛ-36РА - биуретовым методом. Кроме того, определяли содержание ЛПС и рНраствора. К настоящему моменту образцы ИЛ-36РА в растворах всех трёх составов успешнохранятся более года без значимого изменения этих параметров.96Доля частиц размера N (%)А3025201510501100100010000Диаметр частиц (нм)БДоля частиц размера N (%)10+ 20°C+ 25°C+ 30°C+ 40°C+ 45°C+ 50°C+ 35°C302520151050110100Диаметр частиц (нм)ВСерия 01-0216Серия 02-0216Рисунок 44.
Распределение радиусов частиц в растворе относительно их количества прианализе методом дифференциального светорассеяния (ДСР). А – ФС ИЛ-36РА серия 01-0216,не содержащая полисорбат-80, при различных температурах, Б – ФС ИЛ-36РА серия 02-0216,содержащая 0,1% полисорбата-80 при различных температурах, В – сравнение образцов двухсерий, нагрев до +40 °С.97Таким образом, этот раствор ФС (50 мМ цитратный буфер рН 6,0 с 0,1% полисорбата-80)был принят как базовый. Далее требовалось масштабировать схему очистки ИЛ-36РА имодифицировать ее таким образом, чтобы на выходе получать нативный недезамидированныйИЛ-36РА в таком растворе, не превышая в процессе очистки допустимых значений рН (7,0) иконцентрации белка (15 мг/мл).4.2.2. Разработка технологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА вмасштабе лабораторного производства4.2.2.1.Оптимизацияметодализисабиомассыштамма-продуцентаиосветление лизатов методом флоккуляцииВ лабораторных масштабах оптимальным методом лизиса биомассы являлосьтрехкратное замораживание-размораживание биомассы штамма-продуцента с последующимперемешиванием в течение 20 минут и осветлением центрифугированием.
Преимуществамиэтого метода являлись надежность, простота, воспроизводимость и эффективность.При переходе к культивированию в 10-литровом биореакторе, оказалось, чтотрехкратное замораживание-размораживание биомассы весом 270-300 г, получаемой с одногоцикла культивирования, является длительной процедурой и требует нескольких часов. Крометого, лизат имеет повышенную вязкость из-за большого количества ДНК, которая выходит враствор.
Высокая вязкость раствора не позволяет эффективно осветлять его методомцентрифугирования и наносить на хроматографическую колонку.В методику лизиса биомассы были внесены следующие изменения:Для гомогенизации размороженной биомассы был использован блендер. Придальнейшем масштабировании блендер может быть заменен промышленноймешалкой с лезвиями;Подобраны щадящие условия лизиса. Оказалось, что при однократномзамораживании-размораживании биомассы и 10-минутном перемешивании враствор переходит примерно на 30% меньше ИЛ-36РА (Рисунок 45) и заметноменьше ДНК, чем при трехкратном. Поскольку ИЛ-36РА растворим и находится вцитоплазме клеток, а клетки уже повреждены, предположили, что болеедлительное перемешивание лизированной биомассы позволит достичь большего98выхода белка. Из стакана с лизированной биомассой, содержимое которогоинтенсивно перемешивалось, отбирали пробы раствора через каждые полчасапосле начала перемешивания.
Установлено, что после 30 минут перемешиванияконцентрация ИЛ-36РА в растворе не увеличивается и достоверно не отличаетсяот получаемой при более жестких методах лизиса (Рисунок 45, 46).Для 250 г биомассы оправданным оказалось соотношение 1 л лизирующегобуферного раствора (сорбционный буферный раствор для первой стадиихроматографической очистки) на 100 г биомассы. Увеличение объёма раствора неделало лизис более эффективным.МВ, кДа123456Рисунок 45.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
