Диссертация (1145685), страница 16
Текст из файла (страница 16)
На дорожки 1 и 3 нанесено вдвое большее количество образца.Обе полосы специфически реагировали с моноклональными антителами к ИЛ-36РА ввестерн-блоттинге (Рисунок 33), что указывает на наличие общих антигенных эпитопов в86структуре белков и позволяет сделать вывод, что оба белка – это некие формы ИЛ-36РА.Вневосстанавливающих условиях исследованный образец представлен четкой мажорной полосойс кажущейся молекулярной массой около 14 кДа и минорной полосой около 30 кДа (Рисунок32). Последняя, по-видимому, представляет собой димер, образовавшийся при участиидисульфидных связей, поскольку исчезает при добавлении меркаптоэтанола.По данным гель-проникающей ВЭЖХ (Рисунок 34) в исследованном образце следыдимера отсутствуют.
Поэтому образование димера, вероятнее всего, происходит припробоподготовке образца перед внесением в ПААГ. Образование таких димеров ИЛ-36РА принагревании весьма вероятно, поскольку в молекуле ИЛ-36РАприсутствует 5 остатков цистеинаи, значит, есть, по меньшей мере, один неспаренный.Рисунок 34. Хроматограмма элюата после очистки ИЛ-36РА насорбентеButyl-650S,полученная методом гель-проникающей ВЭЖХ.Для проверки гипотезы о том, не является ли одна из полос результатом частичногопротеолиза ИЛ-36РА обе полосы были вырезаны из геля (Рисунок 35), белки из них былиэкстрагированы и подвергнуты триптическому гидролизу. Затем триптические лизаты былипроанализировали с помощью ВЭЖХ-МС-МС (Рисунок 36).МВ, кДа1Рисунок 35.
Электрофореграмма элюата (1) после хроматографической очистки ИЛ36РА на сорбенте Butyl-650 S.87Идентификация полученных пептидов показала, что обе полосы представляют собойИЛ-36РА человека. Степень покрытия для обеих полос была очень высокой (93% для«верхней» и 81% для «нижней» полосы) и в обеих полосах были четко идентифицированы N- иC-концевые фрагменты (Рисунок 36), причем они были полноразмерными. Следовательно, ниодна из полос не является результатом частичного протеолиза ИЛ-36РА.1 MVLSGALCFRMKDSALKVLYLHNNQLLAGGLHAGKVIKGEEISVVPNRWL51 DASLSPVILGVQGGSQCLSCGVGQEPTLTLEPVNIMELYLGAKESKSFTF101 YRRDMGLTSSFESAAYPGWFLCTVPEADQPVRLTQLPENGGWNAPITDFY151 FQQCDРисунок 36.
Перекрытие с референсной последовательностью (UniProt Q9UBH0 [178])аминокислотных последовательностей полученных при ВЭЖХ-МС-МС анализе триптическихлизатов образцов ИЛ-36РА человека. Желтым - последовательности, соответствующиеверхнему бенду; Голубым – нижнему; Зеленым – обоим. Подчеркнут остаток аспарагина в 139положении.Возможным объяснением отличия между двумя исследуемыми формами ИЛ-36РАявляется наличие каких-либо пост-трансляционных модификаций входящих в их составаминокислотныхостатков.Наиболеераспространённымимодификациямипервичнойструктуры белков, происходящими при их выделении, являются окисление, в первую очередь,остатков метионина и цистеина [159] и дезамидирование остатков аспарагина и глутамина [99].Кроме того, небольшое расхождение масс полученных пептидов, соответствующих Сконцевому фрагменту молекулы ИЛ-36РА, с теоретическими значениями, наблюдаемое в рядеслучаев, позволило предположить именно дезамидирование аспарагина.Дезамидированиеаспарагинапроисходитчерезобразованиесукцинимидногопроизводного, которое в основных условиях гидролизуется с образованием аспарагиновой иизоаспарагиновой кислот.
При этом в молекуле полипептида возникает дополнительныйотрицательный заряд, что снижает его изоточку примерно на 0,2 единицы.88Для выяснения причин гетерогенности ИЛ-36РА были проведены эксперименты, вкоторых эти модификации вызывали целенаправленно с помощью обработки раствора белкаперекисью водорода для окисления или с помощью нагревания при рН 9,0 длядезамидирования. Полученные образцы анализировали с помощью ОФ-ВЭЖХ и капиллярногоизоэлектрофокусирования (кИЭФ).После инкубации ИЛ-36РА с 0,03% перекисью водорода при ОФ-ВЭЖХ анализевыявлялось исчезновение основного пика с временем удержания около 10,5 минут, появлениепика с временем удержания около 7 минут (обозначен ** на Рисунке 37), отсутствовавшего внеокисленном исходном препарате, а также увеличение площади пика с временем удержаниячуть менее 10 минут, присутствовавшего в исходном препарате в виде минорной примеси(обозначен * на Рисунке 37) и, вероятно, соответствующего слабо-окисленной форме белка.При инкубации с 0,3% перекисью водорода исчезал и пик слабо-окисленной формы и весьматериал оказался представленным пиком с временем удержания около 7 минут (Рисунок 37).Рисунок 37.
Наложение ОФ-ВЭЖХ хроматограмм образцов ИЛ-36РА: необработанногои обработанных перекисью водорода при различных условиях. * - окисленная форма ИЛ-36РА,** - более сильно окисленная форма ИЛ-36РА.ОФ-ВЭЖХ анализ дезамидированного ИЛ-36РА выявил отсутствие изменения времениудерживания модифицированного белка по сравнению с исходным (Рисунок 38). По-видимому,метод ОФ-ВЭЖХ в использованных условиях не пригоден для определения наличиядезамидированных форм ИЛ-36РА.89Рисунок 38.
Наложение ОФ-ВЭЖХ хроматограмм образцов ИЛ-36РА: до и послеискусственного дезамидирования.Капиллярное изофокусирование оказалось лучшим методом анализа дезамидированияИЛ-36РА. Если исходный образец содержал примерно одинаковые количества изоформ с pI5,23 и 5,05 (Рисунок 39), то после искусственного дезамидирования с помощью нагревания вщелочных условиях доля формы с pI 5,05 резко возросла, а формы с pI 5,23 резко упала(Рисунок 39), что однозначно позволило идентифицировать форму с pI около 5,05 какдезамидированную.
Предположительный сайт дезамидирования был выявлен при анализепоследовательности программой NGOME[165] – это остаток аспарагина в 139 положении(Рисунок 36).Кроме того, кИЭФ оказалось пригодным и для анализа окисленных форм ИЛ-36РА.кИЭФ-анализ окисленного белка показал, что в образце резко увеличивается доля исходноминорных форм с pI примерно на 0,05 единиц выше, чем у нативного и дезамидированногобелка (Рисунок 39).
Таким образом, как нативный, так и дезамидированный белок могут бытьокислены, что сопровождается небольшим, но достаточно хорошо детектируемым увеличениемих изоэлектрической точки.Проведенные эксперименты позволили, во-первых, определить причину возникновениягетерогенности ИЛ-36РА по изоэлектрической точке (дезамидирование); во-вторых, установитьприроду минорного пика на ОФ-ФЭЖХ с временем удержания примерно на 1 минуту меньше,чем у основного пика (окисленная форма ИЛ-36РА); в третьих, определить аналитическиеподходы к контролю дезамидирования и окисления ИЛ-36РА.90Рисунок 39. Наложение результатов капиллярного изоэлектрофокусирования образцовИЛ-36РА без обработки, после обработки перекисью водорода и после искусственногодезамидирования.
Пик pI 5,23 соответствует нативной форме ИЛ-36РА, пик pI 5,06–дезамидированной.* – пик, соответствующий окисленной форме ИЛ-36РА, ** - пик,соответствующий окисленной и дезамидированной форме ИЛ-36РА.Содержание дезамидированной формы существенно вырастает при хранении образцаИЛ-36РА в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,4 при температуре 4-8 °С в течение 3 месяцев(Рисунок 40).Рисунок 40. Наложение результатов капиллярного изоэлектрофокусирования образцовИЛ-36РА: до и после хранения в течение 3 месяцев в фосфатно-солевом буфере (PBS), рН7,4.Пик pI 5,23 соответствует нативной форме ИЛ-36РА, пик pI 5,06 – дезамидированной.91Поскольку основным фактором, определяющим спонтанное дезамидирование остатковаспарагина в составе белковой молекулы, является рН [99], для минимизации влиянияосновных рН изменили схему очистки ИЛ-36РА.
Ранее ИЛ-36РА сорбировали на Q SepharoseFast Flow (GE, США) при рН 8,0. Значение рН буфера, в котором белок наносили на колонку,было снижено до 7,0. При этих условиях ИЛ-36РА не сорбировался и оставался внесвязавшейся фракции (Рисунок 41). Однако, большая часть ДНК и ЛПС по прежнему сильносвязывалась с сорбентом и успешно удалялась в процессе очистки.Параллельно была проведена очистка ИЛ-36РА на том же сорбенте при рН 9,0. В этомслучае ИЛ-36РА иммобилизовался на сорбенте.
После завершения очистки в обоих полученныхобразцах было определено содержание дезамидированной формы ИЛ-36РА (Рисунок 42). ИЛ36РА, выделенный при рН 9,0, содержал 19% дезамидированной формы, в отличие отвыделенного при рН 7,0.12345678910 11 1213МВ, кДаРисунок 41. Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографическойочистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцента на сорбенте Q Sepharose Fast Flow(GE, США), сорбция и элюция при рН 7,0.
Дорожки: 1 – исходный лизат, 2-4 – несвязавшаясяфракция, содержащая ИЛ-36РА, 5-7 – отмывка отмывочным буфером, 8-11 – отмывкаотмывочным буфером с 0,2 М NaCl, 12-13 – отмывка отмывочным буфером с 2 М NaCl.92Рисунок 42. Наложение результатов капиллярного изоэлектрофокусирования образцовИЛ-36РА, выделенных с помощью сорбента Q Sepharose Fast Flow (GE, США) при рН 9,0(пунктирная линия) и 7,0 (сплошная линия). Пик pI 5,23 соответствует нативной форме ИЛ36РА, а пик pI 5,06 – дезамидированной.Таким образом, установлено, что для дезамидирования ИЛ-36РА достаточно дажекратковременного (несколько часов) воздействия значений рН больше 7,0. Дальнейшуюочистку ИЛ-36РА проводили с использованием негативной анионообменной хроматографии насорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США) с сорбцией при рН 7,0.Благодаря тому, что стало возможным выделять нативный недезамидированный ИЛ36РА, выяснилась причина появления второго бенда при электрофоретическом разделении ИЛ36РА.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
