Диссертация (1145685), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Электрофореграммализатов биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА,полученных при различной обработке биомассы: 1 – однократное размораживание,перемешивание 10 минут, 2 – однократное размораживание, перемешивание 30 минут, 3 –однократное размораживание, обработка ультразвуком, 4 – однократное размораживание,перемешивание 30 минут, 5 – двукратное размораживание, перемешивание 30 минут, 6 –трехкратное размораживание, перемешивание 30 минут.99Рисунок 46. Концентрация ИЛ-36РА в лизате после лизиса биомассы различнымколичеством размораживаний и перемешивания 30 минут. Приведено среднее от трёхэкспериментов. Концентрация ИЛ-36РА определена методом ИФА.
Планки отмечаютстандартное отклонение (SD).Для осветления лизата был использован метод флоккуляции, основанный на добавлениив раствор двух солей, образующих при смешивании нерастворимый осадок. Частицы,взвешенные в растворе, становятся очагами кристаллизации, обрастают кристаллами соли,увеличиваются в размере и могут быть легко удалены центрифугированием. Метод обычноприменяется для осветления культуральной жидкости суспензионных эукариотическихклеточных культур [82]. Наиболее часто применяемая смесь - фосфат калия и хлорид кальция,которые образуют нерастворимый в воде фосфат кальция [82].Клизату биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА добавляли при перемешивании фосфаткалия до 20 мМ, хлорид кальция до 30 мМ, оставляли для формирования осадка на 1 час, осадокудаляли центрифугированием при 10000 g в течение 1 часа (Рисунок 47).
Уменьшение времениинкубации раствора после добавления солей до 30 минут или увеличение до 12 часовуменьшило эффективность флоккуляции – лизат хуже осветлялся. При этом при флоккуляциивсё же теряется в среднем около 15% ИЛ-36РА (Рисунок 48).100РисунокАБВГ47.Фотографиилизатовбиомассыштамма-продуцентаИЛ-36РАнапоследовательных стадиях обработки.
А – лизат до осветления, Б – лизат после осветленияцентрифугированием при 10000 g 1 час, В – осветлённый лизат при флоккуляции, Г – лизатпосле флоккуляции и повторного осветления центрифугированием при 10000 g 1 час.12345МВ, кДаРисунок 48. Электрофореграммализатов биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА,полученных на различных этапах процесса флоккуляции: 1 – биомасса штамма-продуцента; 2 –лизат рН 7,0, растворимая фракция; 3 – лизат рН 7,0, осадок; 4 – лизат после флоккуляции,растворимая фракция; 5 – лизат после флоккуляции, осадок.101Таким образом, разработан метод лизиса биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА иосветления лизата методом флоккуляции, позволяющий обрабатывать за один прием биомассуот одного культивирования в 10 л биореакторе с потерями в среднем 27%.
Получаемый лизатпригоден для дальнейшей хроматографической очистки ИЛ-36РА.4.2.2.2.МасштабированиеметодаочисткиИЛ-36РАсприменениеманионообменной хроматографииПроцедурахроматографической очистки была масштабирована для обработки 2,5-3литров лизата, полученного из 270-300 г биомассы штамма-продуцента за один цикл.Были внесены изменения в первую стадию хроматографической очистки ИЛ-36РА негативную анионообменную хроматографию на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США).До этого на колонку с 20 мл сорбента наносили осветленный лизат в 50 мМ буферном растворетрис-HCl, рН 7,0 и собирали несвязавшуюся фракцию.
Назначение этой стадии - очисткараствора ИЛ-36РА от ряда примесных белков, ДНК и ЛПС, которые при рН 7,0 заряженысильнее ИЛ-36РА и, в отличие от него, связываются сорбентом. Примеси затем смывали 2МNaCl в том же буферном растворе.Объем сорбента был увеличен с 20 мл до 300 мл. Для отмывки колонки сорбционныйбуферный раствор 50 мМ трис-HCl, рН 7,0 был дополнен 15 мМ NaCl. За счет этогодостигалось меньшее размывание проходящей фракции, поскольку устранялось даже самоеслабое взаимодействие ИЛ-36РА с сорбентом (Рисунок 49).
После этой стадии хроматографииобъем получаемого образца увеличивается на 30-40% по сравнению с исходным, а потери ИЛ36РА составляют менее 5%.102АБРисунок 49. Хроматограммы очистки ИЛ-36РА из лизата биомассы штамма-продуцентана сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США). А – нанесение образца и отмывка раствором безNaCl, контрольная элюция 100 мМNaCl, регенерация 2 М NaCl; Б – нанесение образца иотмывка раствором с 15 мМ NaCl, регенерация 2 М NaCl.Вторая стадия хроматографической очистки ИЛ-36РА на гидрофобном сорбентеToyopearl Butyl-650 S (Tosoh, Япония) также подверглась изменениям.
Ранее она включаладобавление к содержащему ИЛ-36РА элюату с Q Sepharose Fast Flow (GE, США)кристаллического сульфата аммония до 0,3 М и нанесение его на колонку с Butyl-650 S (Tosoh,Япония), уравновешенную 50 мМ натрий-фосфатным буфером с 0,3 М сульфата аммония, pH1036,5, затем промывку 50 мМ натрий-фосфатным буфером с 50 мМ сульфата аммония, pH 6,5 иэлюцию градиентом отмывочного буфера и воды.Объем сорбента был увеличен с 20 мл до 200 мл. Методика пробоподготовки инанесения проб осталась без изменений. Однако изменение параметров колонки сделанонеэффективной градиентную элюцию ИЛ-36РА: не удавалось достичь разрешения междупиками примесей и ИЛ-36РА, достаточного для получения ИЛ-36РА с чистотой более 95% поОФ-ВЭЖХ.
Поэтому примеси и ИЛ-36РА стали элюировать ступенчато. Примеси удалялипромывкой 50 мМ натрий-фосфатным буферным раствором, рН 6,0 с 50 мМ сульфата аммония.Элюцию ИЛ-36РА затем проводили 50 мМ натрий-фосфатным буферным раствором, рН 6,0 безсульфата аммония. Регенерацию сорбента проводили водой. При этом, если при работе вменьшем масштабе удавалось и при регенерации сорбента водой получить некотороеколичество высокоочищенного ИЛ-36РА, то теперь эта фракция содержала много примесей, иеё стали отбрасывать (Рисунок 50).123456МВ, кДаРисунок 50.
Электрофореграмма фракций, полученных после хроматографическойочистки ИЛ-36РА насорбенте Butyl-650 S (Tosoh, Япония). Дорожки: 1 – исходный образец(несвязавшаяся фракция с Q Sepharose Fast Flow), 2 – несвязавшаяся фракция, 3– отмывкаотмывочным буфером, 4 –элюат,5 – хвост пика элюата,6 – регенерация сорбента.Негативным эффектом масштабирования процесса стало резкое увеличение содержанияЛПС в образцах, полученных после второго этапа очистки.
Это, по-видимому, связано соснижением эффективности первого шага очистки из-за большего насыщения ёмкости сорбентапо сравнению с очисткой в меньшем масштабе. Разрешение на второй стадии очистки такжеснизилось, что сделало невозможным эффективное разделение ЛПС и ИЛ-36РА на104гидрофобном сорбенте. Таким образом, возникла необходимость введения дополнительногоэтапа очистки, связанного с удалением ЛПС из образцов ИЛ-36РА.4.2.2.3.Очистка ИЛ-36РА от ЛПС с помощью разделения фаз с Triton X-114Все методики, применяемые для удаления ЛПС из растворов, используют физикохимические свойства ЛПС – отрицательный заряд углеводного компонента или гидрофобностьлипидногокомпонента.Используются,восновном,хроматографическиеметодики:анионообменная хроматография [26], хроматография на гидроксиапатитных сорбентах [43],гидрофобная хроматография [175], отмывка связанного с сорбентом белка растворомдетергента [86, 109, 154] или органического растворителя [40], а также аффиннаяхроматография на сорбентах, на которых иммобилизованы селективно связывающие ЛПСлиганды, например, полимиксин[7].Нами были опробованы все вышеперечисленные методы, кроме отмывания растворомдетергента связанного с сорбентом белка, т.к.
ИЛ-36РА невозможно сорбировать наанионообменные сорбенты без дезамидирования. Сорбция ИЛ-36РА на катионообменныесорбенты приводила к потерям более 50% белка. ИЛ-36РА высокогидрофобен, поэтому очисткаего от ЛПС с помощью гидрофобных и аффинных сорбентов также приводит к большимпотерям. Так, при пропускании образца ИЛ-36РА через колонку с С8-целлюлозой, потери белкасоставили почти 95%, а после сорбции на бутил-сефарозу (GE, США) белок элюировалсявместе с детергентом. Подобные случаи описаны и для других белков [5]. Таким образом, ниодин из опробованных хроматографических методов не позволил эффективно очистить ИЛ36РА от ЛПС.Альтернативой подходам к очистке от ЛПС, основанным на хроматографии, являетсят.н. двухфазная система с Triton X-114.
В раствор белка, содержащий ЛПС, вводят детергентTriton X-114, охлаждают раствор до +4 °С для увеличения растворимости детергента, затемраствор нагревают выше температуры помутнения этого детергента (+23 °С). Растворимостьдетергента в воде критически снижается, и он образует мицеллы, в которые включается ЛПС.Мицеллы отделяются от раствора центрифугированием. Triton X-114 с ЛПС скапливается внизупробирки в виде отдельной гидрофобной фазы, которая не смешивается с верхней воднойфазой, содержащей белок [5, 24, 83].105Для очистки образца рекомбинантного ИЛ-36РА с содержанием эндотоксина вконцентрации 6800 EU/мл (3400 EU/мг белка) протестировали сначала две концентрации TritonX-114 – 0,25% и 0,125% (объёмные проценты), обработку проводили при +37 °С.В обоих случаях удалось снизить концентрацию ЛПС в растворе менее чем до 5 EU/мл,но при использовании 0,25% Triton X-114 потери ИЛ-36РА были выше (Таблица 1).
Ихпричиной явились в первую очередь потери в объёме получаемого раствора. При каждойобработке объём нерастворимой в воде фракции, содержащей Triton X-114, оказывался немногобольше объёма вносимого 10% раствора детергента. Кроме того, при отборе верхней воднойфазы неизбежно приходилось оставлять немного жидкости, чтобы не захватить часть фракции сTriton X-114. Поэтому на каждом этапе обработки неизбежно терялось около 10% объёмаисходного раствора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
