Диссертация (1145685), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Количество вырабатываемой МАП значительнопревосходило количество ИЛ-36РА. Это вполне объяснимо, т.к. МАП – эндогенный белок E.coli, и, вероятно, и должен более эффективно нарабатываться бактериальной клеткой посравнению с продуктом чужеродного гена. При этом количество МАП не прирастало приувеличении концентрации ИПТГ свыше 0,25 мМ. Количество ИЛ-36РА не увеличивалось приувеличении концентрации ИПТГ свыше 0,5 мМ. Таким образом, оптимальная концентрацияИПТГ составила 0,5 мМ.1234кДа567Рисунок 13.Электрофореграмма лизатов биомассы штамма E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf)(pET15A) после индукции экспресии гена МАП в различных условиях и штаммасравнения. Тонкой черной стрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной массеМАР (31 кДа).
Толстой синей стрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярноймассе ИЛ-36РА (16,8 кДа). Дорожки: 1 – лизат биомассы нетрансформированных E. coliBL21[DE3]; 2 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A) без индукции; 3 –лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), индукция 0,1 мМ ИПТГ; 4 –индукция 0,25м МИПТГ; 5 – индукция 0,5 мМ ИПТГ; 6 – индукция 0,75мМ ИПТГ;7 – индукция1мМ ИПТГ.При электрофоретическом анализе лизатов биомассы штамма с МАП под контролемактивируемого арабинозой промотора наблюдали очень слабое увеличение интенсивностиполосы, соответствующей по массе МАР, в зависимости от концентрации арабинозыпристандартном времени индукции 3 часа (Рисунок 14).
Заметного прироста количества МАП64удалось достичь только при концентрации арабинозы 0,2%. Эту концентрацию выбрали вкачестве оптимальной для дальнейшего сравнения штаммов.123МВ, кДа456Рисунок 14.Электрофореграммализатовбиомассы штамма E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf)(pBAD15A) после индукции экспресии гена МАП в различных условиях и двухштаммов сравнения. Тонкой черной стрелкой отмечена полоса, соответствующая помолекулярной массе МАР (31 кДа). Толстой синей стрелкой отмечена полоса, соответствующаяпомолекулярноймассеИЛ-36РА(16,8кДа).Дорожки:1–лизатбиомассынетрансформированных E. coli BL21[DE3], 2 – лизат биомассы E.
coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)без плазмиды с pBAD15A, 3 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) безиндукции, 4 – индукция 0,002% арабинозы, 5 – индукция 0,02% арабинозы, 6 – индукция 0,2%арабинозы.Для определения оптимального времени индукции экспрессии ИЛ-36РА и МАП для всехштаммов тестировали время индукции 2 и 3 часа. Установили, что в случае всех штаммовоптимальное время индукции 3 часа (Рисунок 15).6512345МВ, кДа 6789Рисунок 15. Электрофореграмма лизатов биомассы штаммов-продуцентов ИЛ-36РАпосле индукции экспрессии генов ИЛ-36РА и МАП в течение 2 и 3 часов.
Тонкой чернойстрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной массе МАР (31 кДа). Толстойсиней стрелкой отмечена полоса, соответствующая по молекулярной массе ИЛ-36РА (16,8 кДа).Дорожки: 1 – лизат биомассы нетрансформированных E. coli BL21[DE3]; 2 –лизат биомассы E.coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), индукция 2 часа; 3 – лизат биомассы E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), индукция 3 часа; 4 – лизат биомассы E.
coliBL21[DE3](pET-IL36Raf), индукция 2 часа; 5 – лизат биомассы E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf), индукция 3 часа; 6 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A),индукция 2 часа; 7 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A), индукция 3часа; 8 – лизат биомассы E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A), индукция 2 часа; 9 – лизатбиомассы E.
coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A), индукция 3 часа.Таким образом, были определены оптимальные условия культивирования полученныхштаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА в колбах. Для всех штаммов времяиндукции составило 3 часа. Концентрации индукторов составили 0,5 мМ ИПТГ для всехштаммов, а также дополнительно 0,2% арабинозы для штамма E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf)(pBAD15A) и 100 мМ рамнозы для штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A).664.1.3. Выбор наиболее продуктивного штамма-продуцента безметионинового ИЛ36РАДля сравнения эффективности отщепления N-концевого метионина от ИЛ-36РА ипродукции ИЛ-36РА штаммами,несущими плазмиду с геном МАП, и штаммом E.coliBL21[DE3](pET-IL36Raf) без плазмиды с МАП провели серию культивирований в колбах.
Изполученных культур отбирали 3 оптических единицы плотности (ОЕ) культуры дляопределения количества ИЛ-36РА методом ИФА. Продукцию ИЛ-36РА рассчитывали какколичество ИЛ-36РА на 1 л среды. Из получаемой бактериальной биомассы выделяли ИЛ-36РАхроматографически в две стадии. Первой стадией была негативная анионообменнаяхроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow (GE, США), второй была гидрофобнаяхроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650 S (Tosoh, Япония). Далее для ускоренноговыделения ИЛ-36РА при определении доли его непроцессиованной формы применялиаффинную хроматографию на сорбенте с иммобилизованными моноклональными антителами кэтому белку.В очищенном ИЛ-36РА примесь непроцессированной метиониновой формы определялис помощью ОФ-ВЭЖХ.
Коэкспрессия с МАП приводила к уменьшению примесинепроцессированной формы ИЛ-36РА. Все три штамма-продуцента, коэкспрессирующие геныИЛ-36РА и МАП, производили ИЛ-36РА, содержащий <3% непроцессированной формы(Рисунок 16,17). Штамм-продуцент ИЛ-36РА, не несущий плазмиды с геном МАП, производилИЛ-36РА, содержащий в среднем 25,6% непроцессированной формы цитокина (Рисунок 16).Продуктивность штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) составила 186 мгИЛ-36РА на 1 л бактериальной культуры (18,6 мкг/ОЕ) и оказалась несколько выше, чем уштаммов E.
coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A) и E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A),однако отличие не было статистически достоверным (Рисунок 18). Достоверно ниже продукцияИЛ-36РА только у штамма E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A) по сравнению с E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf) (Рисунок 18). Причиной таких различий в продуктивности можетслужить более низкая эффективность наработки МАП под контролем промотора araBAD, чем вслучае других использованных промоторов.67Рисунок 16. Сравнение количества непроцесированной формы ИЛ-36РА в препаратахИЛ-36РА, полученных от различных штаммов-продуцентов E. coli.36RA – штамм,трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА; 36RA/MAP-ara, 36RA/MAPlac, 36RA/MAP-rha – штаммы, трансформированные плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА, иплазмидой, несущей ген МАП под контролем различных промоторов: ara (промотор araBAD),rha (промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7).
Иначе: 36RA/MAP-ara – E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf)(pBAD15A), 36RA/MAP-lac – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A), 36RA/MAPrha – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A). Звездочкой указана достоверность отличий приP < 0,05 (t-критерий Стьюдента)Рисунок 17. Наложение типичных ОФ-ВЭЖХ хроматограмм образцов ИЛ-36РА,полученных при коэкспрессии с МАП (сплошная кривая) и без коэкспрессии с МАП(пунктирная кривая).68Производительность штамма-продуцента E.
coli BL21[DE3](pET-IL36Raf), не несущегодополнительной кодирующей МАП плазмиды, была ещё выше и составляла 216 мг ИЛ-36РА на1 л бактериальной культуры (или 21,6 мкг/ОЕ). Однако, отличие от штаммов E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) и E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A) также не былостатистическидостоверным(Рисунок18).Вероятно,дополнительнаянагрузканабактериальную клетку в виде необходимости поддерживать ещё одну плазмиду исинтезировать МАП приводит к снижению продукции ИЛ-36РА.Рисунок 18. Сравнение продукции ИЛ-36РА различными штаммами-продуцентами E.coli.36RA – штамм, трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА;36RA/MAP-ara, 36RA/MAP-lac, 36RA/MAP-rha – штаммы, трансформированные плазмидой,несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущей ген МАП под контролем различных промоторов:ara (промотор araBAD), rha (промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7). Иначе: 36RA/MAP-ara– E.
coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), 36RA/MAP-lac – E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf)(pET15A), 36RA/MAP-rha – E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A). Звездочкойуказана достоверность отличий при P < 0.05 (t-критерий Стьюдента)Существенным преимуществом полученной системы экспрессии безметионинового ИЛ36РА является отсутствие дополнительных технологических этапов, связанных с обработкойМАП получаемого ИЛ-36РА после очистки. Самым существенным усложнением процессаявлялась бы необходимость постоянной параллельной наработки высокоочищенной МАП.
Ктому же МАП является достаточно термолабильным ферментом, не подлежащим хранению в69течение более 1 года даже при - 70 °С. Кроме того, при масштабировании производства ИЛ36РА потребовалось бы симметричное масштабирование производства МАП и введениедополнительных шагов в технологический процесс, связанных со сменой буфера в образце. Поэтим причинам коэкспрессия генов ИЛ36РА и МАП – и, таким образом, обработка ИЛ-36РАМАП in vivo – является более простым и экономичным способом получения безметиониновогоИЛ-36РА, даже с учётом некоторого снижения его продукции.Разработанная система коэкспрессии ИЛ-36РА с МАП в достаточной мере универсальнаи может быть применена для получения и других рекомбинантных белков.
Однако следуетиметь в виду также и ряд ограничений этой системы, возникающих, главным образом, из-заприроды самой МАП E. coli.Так, МАП обладает выраженной субстратной специфичностью: онаможет эффективно удалять N-концевой остаток метионина белковой молекулы только в томслучае, когда следующий за ним аминокислотный остаток имеет радиус вращения своейбоковой цепи не более 0,143 нм, как, например, остаток глицина или аланина[12].Таким образом, очень неудачным объектом для МАП является, например, интерферонα2b человека, в молекуле которого есть замкнутая дисульфидная связь с остатком цистеина,следующим сразу за инциаторным остатком метионина [146]. Тем не менее, остаток цистеина впринципе имеет хиральный радиус бокового радикала, равный 1,22 ангстрем [76], т.е.процессинг молекулы с помощью МАП возможен, пока дисульфидная связь не замкнута.
Этаситуация вполне возможна в случаях, когда ИФН-α2b производится в клетке в растворимомвиде, а количество МАП в клетке достаточно для его своевременного процессинга, и когдарефолдинг и обработка ИФН-α2b МАП проводятся in vitro.Для обработки подобных сложных объектов получена модифицированная МАП снесколькими заменами в аминокислотной последовательности, способная игнорировать этистерические ограничения[81].
Авторы утверждают, что примерно 85-90% известных белковмогутбытьпроцессированымодифицированнаяМАПэтойможетМАП.отщеплятьОднакоиавторыследующийтакжезаотмечают,остаткомчтометионинааминокислотный остаток, если третий остаток в цепи имеет боковую цепь небольшого радиуса[81].Другим вариантом обхода проблемы со специфичностью МАП по отношению кизучаемому объекту могло бы стать использование другой N-концевой аминопептидазы,способной отщеплять остаток метионина. Например, лейцин-аминопептидазы E. coli (белокPepA) [14].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
