Диссертация (1145685), страница 8
Текст из файла (страница 8)
В сосуд помещали 6,5 л дистиллированной воды и 2 мл пеногасителя,герметизровали сосуд ватно-марлевыми пробками и фольгой. Сосуд ферментера стерилизовалив автоклаве в течение 30 минут при температуре +121 °С и давлении 1 кг/см2. Вносимые далеерастворы, кроме растворов антибиотиков, автоклавировали заранее в тех же условиях, что иферментер. Растворы антибиотиков готовили в асептических условиях в стерильной посуде.Автоклавированный сосуд ферментера помещали на станину и подключали кконтрольному блоку.
После запуска мешалки в асептических условиях в ферментер вносили 0,5л 20-кратного раствора солей M9, 1,5 л концентрированной питательной среды, содержащей247,5 г гидролизата казеина и 105 г дрожжевого экстракта, 5 мл 10% раствора магниясернокислого, 25 мл 0,4% раствора кальция хлористого, 10 мл 10% раствора ампициллина, 10мл 2,5% раствора хлорамфеникола.
Затем в сосуд ферментера вводили датчики рН и рО2,плотно герметизировали их втулками.Через 5-10 минут доводили рН до 7,0±0,1 с помощью 25% раствора натрия гидроокисиили 20% раствора ортофосфорной кислоты. После этого включали подачу воздуха с расходом 4л/мин, мешалку на скорости 200 об/мин и добивались установления стабильных показанийдатчика рО2. После достижения заданной температуры и стабилизации показаний датчика37принимали текущий уровень рО2 за 100%. В дальнейшем поддержание рН и аэрациипроводилось автоматически в период всего процесса культивирования.Затем в ферментер вводили посевную культуральную жидкость объемом 0,8 л черезстерильную воронку в пламени спиртового факела при отключенной подаче воздуха. Поокончании посева технологическое отверстие заглушали и подачу воздуха возобновляли впрежнем режиме.
Через 1 час после начала культивирования, с интервалом в 1 час, отбиралипробы объемом 3,5 мл для измерения оптической плотности культуральной жидкости наспектрофотометре (длина волны 600 нм, толщина слоя в кювете 1 см).Поисчерпаниювсредеглюкозы,чтофиксируетсязащелачиваниемсредыкультивирования и резким снижением потребления кислорода, вводили питательную добавку,содержащую 82,5 г гидролизата казеина и 35 г дрожжевого экстракта, объемом 0,5 л.При достижении биореактором температуры +30 °С вносили 5,0 мл растворапеногасителя, 25 мл 1М раствора изопропил β-D-тиогалактозида (ИПТГ) и 20 мл 20% раствораL-арабинозы.
Все остальные параметры культивирования поддерживали на прежнем уровне. Спериодичностью в 0,5 или 1 час контролировали динамику изменения оптической плотности.Через час и через 2 часа после введения ИПТГ в среду вводили по 8 мл 20% раствора Lарабинозы. Отсчет времени индукции начинали с момента ввода индуктора.После истечения запланированного времени индукции биомассу штамма-продуцентаИЛ-36РА собирали с помощью проточной центрифуги Z-41 (СЕРА, Германия) на скорости 5000об/мин при скорости подачи раствора 1 л/мин. Культуральная жидкость подавалась черезстерильный шланг сливного штуцера ферментера при сохранении избыточного давления.Полученную биомассу замораживали при -70 °С в чашках Петри. Вес получаемой биомассысоставлял 270-300 г.3.3. Лизис биомассы клеток штаммов-продуцентов ИЛ-36РАНа этапе культивирования штаммов-продуцентов ИЛ-36РА в колбах биомассулизировалипутемразмораживанияпритрехкратногокомнатнойпоследовательноготемпературе.замораживанияЛизированнуюприбиомассу°Сиразводилив-20сорбционном буферном растворе для анионообменной хроматографии на сорбенте Q SepharoseFast Flow (50 мМ трис-HCl, pH 7,0) из расчёта 20 мл буфера на 1 г биомассы.
После этого лизатперемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем38удаляли клеточный дебрис центрифугированием при 13500 g в течение 30 минут. Переднанесением на сорбент полученный лизат фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм.Для лизиса биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА Escherichia coli BL21Star[DE3](pETIL36Raf, pBAD15A), получаемой в ферментере количествах порядка 300 г использовалиоптимизированный метод. Замороженную биомассу клеток штамма-продуцента ИЛ-36РАпомещали в эмалированный поддон и размораживали при комнатной температуре в течение 3040 минут до частичного размягчения. При помощи ножа из нержавеющей стали биомассуизмельчали на куски размером 2-3 см. Измельчённую биомассу помещали в стакан емкостью 5л и добавляли буферный раствор (50 мМ трис-HCl, pH 7,0) из расчёта 10 мл буфера на 1 гбиомассы. Биомассу перемешивали блендером MS 5000/01 FD1 (Bosch, Германия) в течение 2-3минут до получения однородной суспензии.
Емкость с суспензией помещали под погружнуюмешалку и перемешивали в течение 30-60 минут при комнатной температуре. Затем удаляликлеточный дебрис центрифугированием при 9500-10000 g в течение 60 минут.3.4. Осветление лизата биомассы клеток штамма-продуцента ИЛ-36РАВ работе использованы следующие методы осветления лизатов.3.4.1. ФлоккуляцияВ случаях, когда получаемый лизат планировали нанести на анионообменный сорбент QSepharose Fast Flow (GE, США), применяли метод флоккуляции.
Для этого полученный послецентрифугирования полуосветлённый лизат сливали в стакан, который помещали подпогружную мешалку. Затем добавляли 1 М раствор однозамещенного калия фосфата до 20 мМи 3 М раствор кальция хлористого до 30 мМ, перемешивали лизат в течение 2 минут прикомнатной температуре и инкубировали 1 час при комнатной температуре без перемешивания.Образовавшийся осадок удаляли центрифугированием при 9500-10000 g в течение 60 минут.3.4.2.
Кислотное фракционированиеВ случаях, когда получаемый лизат планировали нанести на катионообменный сорбентSP Sepharose Fast Flow (GE, США), применяли метод кислотного фракционирования. Для этогополученный после центрифугирования полуосветлённый лизат сливали в стакан, которыйпомещали под погружную мешалку. В лизат погружали электрод рН-метра и добавляли 50%уксусную кислоту до достижения значения рН 4,0.
Затем удаляли образовавшийся осадокцентрифугированием при 9500-10000 g в течение 60 минут.393.5. Хроматографическая очистка ИЛ-36РАОсвоение методов хроматографической очистки белков и первые шаги в интерпретациирезультатов и оптимизации методик были сделаны под руководством Протасова Е.А.. Также впроведении экспериментов по оптимизации методик хроматографической очистки ИЛ-36РАпринимали участие Антипова Т.О. и Атанесян В.А.. Автор приносит свою глубочайшуюблагодарность за эту помощь.В ходе работы применяли три схемы выделения ИЛ-36РА из биомассы штаммапродуцента в зависимости от масштабов культивирования.Для выделения ИЛ-36РА из культуры штамма-продуцента, наращиваемой в колбах,использовали сорбционную анионообменную хроматографию на сорбенте Q Sepharose FastFlow (GE, США) и гидрофобную хроматографию на сорбенте Toyopearl Butyl-650 (Tosoh,Япония). В этом случае работы проводили при комнатной температуре с использованиемхроматографа ActaPrime Plus (GE, США) и преднабитых колонок HiTrap (GE, США), а такжестеклянных колонок Eco (YMC, Германия) с внутренним диаметром 25 мм.Для выделения ИЛ-36РА из культуры штамма-продуцента, наращиваемой в 10 лбиореакторах, использовали негативную анионообменную хроматографию на сорбенте QSepharose Fast Flow (GE, США) и гидрофобную хроматографию на сорбенте Toyopearl Butyl650 (Tosoh, Япония).
В этом случае работы проводили при комнатной температуре сиспользованием хроматографа ActaPrime Plus (GE, США) и стеклянных колонок Eco (YMC,Германия) с внутренним диаметром 50 и 70 мм.Для выделения ИЛ-36РА из культуры штамма-продуцента, наращиваемой в 250 лбиореакторе, использовали катионообменную хроматографию на сорбенте SP Sepharose FastFlow (GE, США) и гидрофобную хроматографию на сорбенте Toyopearl Butyl-650 (Tosoh,Япония). В этом случае работы проводили при +4°С в холодильном шкафу Combicold (LKB,Швеция) с использованием перистальтического насоса Multiperpex (LKB, Швеция) истеклянных колонок Eco (YMC, Германия) с внутренним диаметром 50 мм, а также стекляннойколонки (Pharmacia, Швеция) с внутренним диаметром 150 мм.3.5.1.
Анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast FlowСорбент Q Sepharose Fast Flow (GE, США) в количестве 20 мл помещали в стекляннуюколонку 25*200 мм (YMC, Германия) или в количестве 300 мл в колонку 70*200 мм (YMC,Германия). Перед работой проводили регенерацию сорбента, последовательно промывая егопятью объёмами регенерирующего раствора (50 мМ трис-HCl, 2M NaCl, pH 7,0), и пятью40объёмами 20% этанола со скоростью 10 мл/мин в случае малой колонки и 25 мл/мин в случаебольшой колонки.
Затем для уравновешивания сорбент промывали тремя объёмамисорбционного буферного раствора (50 мМ трис-HCl, pH 7,0).В случае сорбционной хроматографии ИЛ-36РА сорбировали, пропуская через колонкуосветленный лизат биомассы штамма-продуцента, в сорбционном буферном растворе (50 мМтрис-HCl, pH 7,0). Затем колонку промывали отмывочным буферным раствором (50 мМ трисHCl, 15мM NaCl, pH 7,0). ИЛ-36РА элюировали 50 мМ трис-HCl, 50 мM NaCl, pH 7,0.
Колонкурегенерировали, как описано выше.В случае негативной хроматографии сорбцию примесных белков, нуклеиновых кислот илипополисахаридов проводили, пропуская через колонку осветленный лизат биомассы штаммапродуцента, в сорбционном буферном растворе (50 мМ трис-HCl, pH 7,0). Затем смывалиостаточные количества слабо сорбировавшегося на колонку ИЛ-36РА отмывочным буфернымраствором (50 мМ трис-HCl, 15мM NaCl, pH 7,0), соединяли несвязавшуюся фракцию спромывочной и использовали для дальнейшей очистки ИЛ-36РА. Колонку регенерировали, какописано выше.3.5.2. Катионообменная хроматография на сорбенте SP Sepharose Fast FlowСорбент SP Sepharose Fast Flow (GE, США) в количестве 20 мл помещали в стекляннуюколонку 25х200 мм (YMC, Германия) или в количестве 500 мл в колонку 150*200 мм(Pharmacia, Швеция).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
