Автореферат (1145683)
Текст из файла
На правах рукописиКолобовАлексей АлександровичПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТАГОНИСТАРЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА 36 ЧЕЛОВЕКА И ИЗУЧЕНИЕЕГО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХСВОЙСТВ03.01.04 – биохимияАВТОРЕФЕРАТДиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург – 20172Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультетаФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»Научный руководительСтефанов Василий Евгеньевичкандидат биологических наук, доцент,заведующий кафедрой биохимии биологическогофакультета ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургскийгосударственный университет», г.
Санкт-ПетербургОфициальные оппонентыБуров Сергей Владимировичдоктор химических наук, старший научныйсотрудник, заведующий лабораторией синтезапептидов и полимерных микросфер, ФГБУН «Институтвысокомолекулярных соединений», г. Санкт-ПетербургКалинина Наталья Михайловнадоктор медицинских наук, профессор, главныйнаучный сотрудник отдела лабораторнойдиагностики, ФГБУ «Всероссийский центрэкстренной и радиационной медициныим. А.М. Никифорова» МЧС России, г.
Санкт-ПетербургВедущая организация: ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»Федерального агентства научных организаций России, г. Санкт-ПетербургЗащита состоится 21 декабря 2017 г. в 14:00 часов на заседанииДиссертационного совета Д.212.232.10 по защите докторских и кандидатскихдиссертаций на базе ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственныйуниверситет» по адресу: 199034, г.
Санкт-Петербург, Университетская наб.,7/9, ауд. 90С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А.М. ГорькогоФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет» по адресу:199034, Санкт-Петербург, Университетская наб.
д. 7/9, а также на сайтеСанкт-Петербургскогогосударственногоуниверситетапоадресу:https://disser.spbu.ru/files/disser2/disser/bzPnDbCn9D.pdfe-mail: n.alekseev@spbu.ruтел.: +7 (812) 328-95-74Автореферат разослан «____» октября 2017 г.Учёный секретарьДиссертационного совета 212.232.10,доктор биологических наук, профессорН.П.
Алексеев3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темы исследованияРабота проводилась в рамках проекта по разработке перспективныхподходов к терапии псориаза.Псориаз является многофакторным заболеванием, поражающим до 5%населения в экономически развитых странах. Псориатический артритразвивается у 5-25% больных псориазом, проявляется симметричнымидеструктивными изменениями суставов (Boehncke, Schön, 2015). В Россиипроживает более 300 тысяч больных псориазом (Мишина et al., 2012). Помимовульгарного псориаза выделяют более тяжёлые формы заболевания,характеризующиеся обширными болезненными высыпаниями, их особеннойлокализацией, образованием пустул, поражением суставов и системнымирасстройствами.Наиболеетяжёлойформойпсориазаявляетсягенерализованный пустулёзный псориаз (ГПП).Для лечения среднетяжелых и тяжелых форм псориаза, наряду сосредствами местного лечения и системными иммунодепрессантами (Kelly et al.,2015) в последние год широкое применение получили фармацевтическиепрепараты с антицитокиновой активностью.
Высокую клиническуюэффективность демонстрируют препараты, нейтрализующие биологическуюактивность фактора некроза опухолей-альфа (Saikaly, Mattes, 2016), блокаторырецептора интерлейкина (ИЛ)-12 и ИЛ-23 (Papp et al., 2015), терапевтическиеантитела против ИЛ-17А (Ryoo et al., 2016).Важную роль в активации и поддержании воспаления в коже, пораженнойпсориазом, играют цитокины семейства ИЛ-36. Это семейство включает трипровоспалительных цитокина - ИЛ-36α, ИЛ-36β и ИЛ-36γ - и специфическийантагонист рецептора ИЛ-36 (ИЛ-36РА). Ряд мутаций в гене IL36RN,кодирующем ИЛ-36РА, способен вызывать развитие генерализованногопустулёзного псориаза.Предполагается, что блокада активации рецептора ИЛ-36 с помощьювведениярекомбинантногоИЛ-36РАчеловекаможетбытьвысокоэффективным подходом к терапии данного дерматоза.
В связи с этимразработка новых лекарственных средств на основе ИЛ-36РА для леченияпсориаза является актуальной задачей.Настоящее исследование посвящено разработке методик получениярекомбинантного ИЛ-36РА человека в бактериальном продуценте и егоочистки, а также изучению физико-химических свойств и биологическойактивности полученного цитокина. Результаты проведенных исследованийлегли в основу лабораторного и опытно-промышленного регламентовполучения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА.4Степень разработанности темыНаиболее тяжёлые формы псориаза, такие как генерализованныйпустулёзный псориаз, не отвечают на обычную терапию.
Для их леченияактивно применяют различные антицитокиновые иммуносупрессивныепрепараты. Это этанерцепт (внеклеточный домен рецептора ФНОα, сшитый сFc-фрагментом IgG1 человека), инфликсимаб и адалимумаб (моноклональныеантитела к ФНОα) (Saikaly, Mattes, 2016), секукинумаб (моноклональныеантитела к ИЛ-17А) (Ryoo et al., 2016), устекинумаб (моноклональные антителак общей для ИЛ-12 и ИЛ-23 субъединице p40) (Papp et al., 2015) и др.
Однако,эти препараты обладают системными побочными эффектами (Garber et al.,2015; Ryoo et al., 2016; López-Ferrer et al., 2017). В связи с этим разработкапрепаратов, селективно действующих на уровне наружных кожных покровов,например, ингибирующих активность ИЛ-36, является актуальнойпрактической задачей (D’Erme et al., 2015).В настоящее время разрабатывается несколько таких препаратов.Моноклональные антитела к рецептору ИЛ-36 независимо полученыкомпаниями Boehringer Ingelheim (Германия) (Ganesan et al., 2017) и AnaptysBio (США) (Bowers et al., 2016).
Оба препарата находятся на первой стадииклинических испытаний. Преимущество разрабатываемого препарата на основерекомбинантного ИЛ-36РА человека в использовании при его производствепрокариотического продуцента и неаффинных методов очистки, чтообуславливает меньшую стоимость его производства. Получение ИЛ-36РА сотщеплённым N-концевым остатком метионина (безметионинового) позволяетдобиться максимальной биологической активности препарата.Цель данной работы - получение рекомбинантного безметиониновогоантагониста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физикохимических и биологических свойствЗадачи:1.
Создать бактериальный штамм-продуцент рекомбинантногобезметионинового ИЛ-36РА человека2. Разработать технологию получения фармацевтической субстанцииИЛ-36РА3. Изучить физико-химические свойства полученного ИЛ-36РА4. Изучить биологические свойства полученного ИЛ-36РАНаучная новизнаТехнология получения безметиониновых белков, состоящая в созданииштамма, несущего плазмиду с геном интереса и плазмиду с геномметионинаминопептидазы, применена по отношению к ИЛ-36РА впервые.Кроме того, впервые исследованы пост-трансляционные модификации ИЛ36РА, изучено их влияние на его биологическую активность, подобраныусловия выделения и очистки ИЛ-36РА, минимизирующие эти изменения.5Впервые разработана технология получения биологически активного ИЛ36РА, позволяющая получать до 10 г высокоочищенного ИЛ-36РА из 160 лкультуры в течение трехнедельного производственного цикла.Теоретическая и практическая значимость работыПроведенное исследование физико-химических свойств ИЛ-36РА,позволяющее более полно понимать механизм действия этого цитокина ворганизме млекопитающих, определяет теоретическую значимость работы.
Тотфакт, что ИЛ-36РА человека способен купировать псориазоподобный фенотипу мышей, является прямым доказательством структурной схожести ИЛ-36РАчеловека и мыши, и косвенным доказательством относительно недавнеговозникновения семейства ИЛ-36 в эволюции.Практическая ценность работы состоит в разработке промышленнойтехнологии получения фармацевтической субстанции ИЛ-36РА человека сдоказанной биологической активностью, на основе которой изготавливаетсяготовая лекарственная форма ИЛ-36РА в виде раствора для подкожноговведения, 5 мг/мл. Успешно завершены доклинические испытанияэффективности и безопасности препарата в качестве кандидатноголекарственного средства для терапии тяжёлых форм псориаза.Методология и методы исследованияВ ходе работы создан штамм-продуцент на основе E.
coli BL21[DE3],синтезирующий растворимый биологически активный рекомбинантный ИЛ36РА человека с отщепленным N-концевым остатком метионина. Для этогоштамм трансформирован плазмидой, несущей ген, кодирующий ИЛ-36РАчеловека, и плазмидой, несущей ген метионинаминопептидазы E. coli.Разработана схема двухстадийной хроматографической очистки ИЛ-36РА,включающей катионообменную и гидрофобную хроматографию. Изученыпост-трансляционные модификации полученного препарата ИЛ-36РА, показанаспособность ИЛ-36РА к спонтанному дезамидированию при значениях рНсреды выше 7, показана зависимость биологической активности ИЛ-36РА ототщепления N-концевого инициаторного остатка метионина. Биологическаяактивность полученного препарата ИЛ-36РА подтверждена in vitro в модельнойсистеме на основе клеточной линии А549. Также показана способностьполученногопрепаратаИЛ-36РАкупироватьиндуцированныйпсориазоподобный фенотип у мышей при подкожном введении.Положения, выносимые на защиту1.
Создана серия штаммов-продуцентов безметиониновогорекомбинантного ИЛ-36РА человека на основе E. coli BL21[DE3].Установлено, что штамм E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A)наиболее продуктивен и обеспечивает получение ИЛ-36РА ссодержанием непроцессированной формы менее 5%.62. Биологическая активность получаемого ИЛ-36РА соответствуетбиологической активности коммерческого стандартного препарата.3.
Установлено, что в процессе выделения и хранения при рН > 7,0 препаратИЛ-36РА подвергается дезамидированию.4. Подобраны условия выделения и хранения ИЛ-36РА, минимизирующиеего дезамидирование.5. Впервые разработан метод получения ИЛ-36РА, позволяющий получать8-10 г высокоочищенного ИЛ-36РА за один производственный цикл(заявка на патент РФ № 2017103888 от 06.02.2017).Степень достоверности и апробация результатовПо теме диссертации опубликовано 2 статьи, 5 тезисов докладов и подана1 заявка на патент (Рег. № 2017103888 от 06.02.2017).Работа прошла практическую апробацию. Препарат ИЛ-36РА,полученный по разработанной методике, успешно прошёл доклиническиеиспытания в качестве кандидатного лекарственного средства для терапиитяжёлых форм псориаза.Личное участие автора в получении результатовЛичный вклад автора состоит в личном участии в проведении всех этаповработ: в организации и проведении экспериментов, планировании работ,подборе и оптимизации производственных и аналитических методик,теоретическом обобщении и статистической обработке результатов, подготовкек публикации статей, патентов и отчётов по теме, а также в руководственаучной группой.
Экспериментальная часть работы выполнена на базе ФГУП«Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России.Ряд исследований проведён совместно с сотрудниками ФГУП «Гос.НИИОЧБ» Кондратьевой Е.В., Кудлинг Т.В. (генная инженерия) и к.м.н. ПетровымА.В. (тестирование биологической активности ИЛ-36РА). Работы покультивированию штамма-продуцента ИЛ-36РА в пилотном биореакторепроводились на базе ИБФМ РАН под руководством к.б.н. Самойленко В.А..Все полученные совместно результаты опубликованы или в настоящеевремя по ним готовятся совместные публикации.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
