Автореферат (1145683), страница 3
Текст из файла (страница 3)
coli,составила лишь 44% от активности стандартного образца (Рисунок 4). Этиданные соответствуют литературным данным о том, что непроцессированныйИЛ-36РА с N-концевым остатком метионина не обладает биологическойактивностью (Towne et al. 2011).12Рисунок 4.
Биологическая активность ИЛ-36РА от различных штаммовпродуцентов E. coli по сравнению со стандартным образцом. 36RA – штамм,трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА; 36RA/MAPara, 36RA/MAP-lac, 36RA/MAP-rha – штаммы, трансформированныеплазмидой, несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущей ген МАП подконтролем различных промоторов: ara (промотор araBAD), rha (промоторrhaBAD), lac (промотор lac/T7); стандарт – коммерческий ИЛ-36РА (1275-IL025, R&D Systems, США). * р < 0,05 (t-критерий Стьюдента). Отмеченыстандартные отклонения (SD).Для дальнейшего масштабного культивирования был выбран штамм E.coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) как наиболее продуктивный иобеспечивающий эффективный процессинг ИЛ-36РА.Биологическая активность получаемого от этого штамма ИЛ-36РА in vivoбыла подтверждена в модели псориазоподобного дерматита на мышах,вызванного накожным нанесением агониста TLR-7 и TLR-8 имихимода втечение 7 дней.
Параллельные подкожные инъекции ИЛ-36РА в дозах 10мкг/мышь (50 мкг/кг) и 50 мкг/мышь (250 мкг/кг) значительно ослаблялипровоспалительное действие имихимода (Рисунок 5).13АБРисунок 5. Уши мышей после пяти дней обработки имихимидом на фоневведения подкожно в холку физиологического раствора (А) и ИЛ-36РА (Б).Таким образом, получаемый ИЛ-36РА обладает биологическойактивностью, подтверждённой in vitro и in vivo, и может быть использован вкачестве активного фармацевтического ингредиента при создании новоголекарственного средства для терапии псориаза.Масштабированиекультивированиябезметионинового ИЛ-36РАштамма-продуцентаМасштабирование процесса культивирования штамма E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) проведено в условиях автоматическогоферментера в 1- и 10-литровых сосудах биореактора «BIOFLO-110»(NewBrunswick, США) (Рисунок 6).Рисунок 6.
Общее количество продуцируемого культурой ИЛ-36РА взависимости от времени культивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) в 10-литровом сосуде биореатора.Средние значения от трёх последовательных культивирований, вертикальныепланки обозначают SD.14При первых культивированиях не удавалось добиться эффективнойработы МАП – получаемый ИЛ-36РА содержал до 50% непроцессированнойформы. Эффективность наработки ИЛ-36РА не изменилась. Внесениедополнительных 0,8 г/л арабинозы 1 раз в час позволило снизить содержаниенепроцессированной формы в получаемом ИЛ-36РА до 5%.Культивированиештамма-продуцентавмасштабахпилотногопроизводства в биореакторе объёмом 250 л (рабочий объём культуры 160 л)проводили по тому же протоколу.
Единственным отличием сталоиспользование 2-кратной среды LB без последующей питательной добавки. Вэтом случае ИЛ-36РА был получен в 14-18 раз больших количествах, чем в 10 лбиореакторе.Изучение окисления и дезамидирования ИЛ-36РАНа электрофореграмме ИЛ-36РА после хроматографической очистки вобласти, соответствующей ИЛ-36РА, наблюдается два бенда (Рисунок 7). Спомощью ВЭЖХ-МС удалось установить, что оба бенда являются ИЛ-36РА.Для выяснения причин его гетерогенности ИЛ-36РА был окислен с помощьюперекиси водорода и дезамидирован при нагревании при рН 9,0. Полученныеобразцы анализировали с помощью капиллярного изоэлектрофокусирования(кИЭФ) (Рисунок 8).
Оказалось, что гетерогенность ИЛ-36РА приэлектрофоретическоманализеопределяетсядезамидированием.Предположительный сайт дезамидирования был выявлен при анализепоследовательности программой NGOME (Lorenzo et al., 2015) – это остатокаспарагина в 139 положении.123МВ, кДаРисунок 7. Электрофореграмма образцов ИЛ-36РА, содержащих разноеколичество дезамидированной формы белка: 1 – 1,3%, 2 – 5%, 3 – 43%.15Рисунок8.Наложениерезультатовкапиллярногоизоэлектрофокусирования образцов ИЛ-36РА без обработки, после обработкиперекисью водорода и после искусственного дезамидирования. Пик pI 5,23соответствует нативной форме ИЛ-36РА, пик pI 5,06 – дезамидированной.* –пик, соответствующий окисленной форме ИЛ-36РА, ** - пик, соответствующийокисленной и дезамидированной форме ИЛ-36РА.Данная модификация не влияет на биологическую активность ИЛ-36РА.Однако дезамидирование, как правило, дестабилизирует пространственнуюструктуру белка, поэтому его следует избегать.Посколькуосновнымфактором,определяющимспонтанноедезамидирование остатков аспарагина в составе белковой молекулы, являетсярН, для минимизации влияния основных рН была изменена схема очистки ИЛ36РА.
Ранее ИЛ-36РА сорбировали на Q Sepharose Fast Flow (GE, США) при рН8,0 и выше. Значение рН буфера, в котором белок наносили на колонку, былоснижено до 7,0, что позволило получать на выходе недезамидированный белок(Рисунок 9). В этих условиях ИЛ-36РА не сорбировался и оставался внесвязавшейся фракции. Однако большая часть ДНК и ЛПС по-прежнемусильно связывалась с сорбентом и успешно удалялась в процессе очистки.16Рисунок9.Наложениерезультатовкапиллярногоизоэлектрофокусирования образцов ИЛ-36РА, выделенных с помощьюсорбента Q Sepharose Fast Flow (GE, США) при рН 9,0 (пунктирная линия) и 7,0(сплошная линия).
Пик pI 5,23 соответствует нативной форме ИЛ-36РА, а пикpI 5,06 – дезамидированной.Оптимизация условий хранения ИЛ-36РАПоскольку лиофильное высушивание белков часто провоцируетокисление и агрегацию белка, фармацевтическую субстанцию (ФС) ИЛ-36РАприготовили в виде раствора. Были оптимизированы состав, рН раствора иконцентрация активного фармацевтического ингредиента.При снижении рН раствора белка ниже 5,5 наблюдалась интенсивнаяагрегация белка, т.к.
его изоэлектрическая точка 5,2. Признаки агрегации ненаблюдались при хранении ИЛ-36РА при рН 7,4 в концентрации менее 10мг/мл, однако при концентрации выше 15 мг/мл происходило выпадение восадок большей части белка. Содержание дезамидированной формысущественно возрастало при хранении образца ИЛ-36РА в течение 3 месяцев вфосфатно-солевом буфере (PBS), рН 7,4 при температуре +4-8 °С. Содержаниеокисленной формы при этом не изменялось.Были изготовлены три опытные партии ФС ИЛ-36РА с концентрациейИЛ-36РА 10 мг/мл на основе:1.50 мМ цитратного буфера (рН 6,0).2.50 мМ цитратного буфера (рН 6,0) с полисорбатом-80 (0,1%)3.50 мМ цитратного буфера (рН 6,0) с полисорбатом-80 (0,1%) иэдетатом натрия (1 мМ).Для предварительного анализа стабильности проведено изучениетермостабильности ИЛ-36РА в исследуемых композициях методомдинамического светорассеяния (ДСР).
Значимых различий в динамике17агрегации при нагреве между двумя образцами ФС, содержащим и несодержащим полисорбат-80, обнаружено не было (Рисунок 10).Доля частиц размера N, %302520151050110100Диаметр частиц, нмСерия 01-0216Серия 02-0216Рисунок 10. Распределение радиусов частиц в растворе относительно ихколичества при анализе методом дифференциального светорассеяния (ДСР). А– ФС ИЛ-36РА серия 01-0216, не содержащая полисорбат-80, и ФС ИЛ-36РАсерия 02-0216, содержащая 0,1% полисорбата-80, нагрев до +40 °С.50 мМ цитратный буфер рН 6,0 с 0,1% полисорбата-80 был выбран вкачестве основы для приготовления ФС ИЛ-36РА. Дальнейшеемасштабирование схемы очистки ИЛ-36РА проведено таким образом, чтобы навыходе получать нативный недезамидированный целевой белок в раствореуказанного состава, не превышая в процессе очистки допустимых значений рН(7,0) и концентрации белка (15 мг/мл).Исследование стабильности продолжили при длительном храненииобразцов ФС ИЛ-36РА при + 4-8 °С.
Раз в 3 месяца их свойства исследуют всоответствии с проектом фармацевтической статьи предприятия (ФСП).Оценивают прозрачность, цвет и рН раствора, концентрацию ИЛ-36РА, егобиологическую активность, наличие родственных и неродственных емупримесей, концентрацию ЛПС. Образцы ФС ИЛ-36РА в настоящее времяхранятся без изменения своих свойств уже более года.Очистка ИЛ-36РА от ЛПС с помощью разделения фаз с Triton X-114При масштабировании процесса хроматографической очистки ИЛ-36РАвозникла необходимость разработки метода удаления ЛПС. Применили методразделения фаз с детергентом Triton X-114.18Протестировали две концентрации Triton X-114 – 0,25% и 0,125%.
Приобработке при +37 °С в обоих случаях удалось снизить концентрацию ЛПС врастворе до 2-4 EU/мл, но при использовании 0,25% Triton X-114 потери ИЛ36РА были в 2 раза выше. При +30 °С обработку Triton X-114 в концентрации0,125% проводили дважды. Концентрацию ЛПС в растворе удалось снизить до30 EU/мл после первой обработки и до 0-4 EU/мл после второй. Потери объёмаобразца ИЛ-36РА на каждом этапе обработки 0,125% Triton X-114 при +30 °Ссоставили 4-5%. Концентрация ИЛ-36РА в растворе оставалась неизменной.Таким образом, с точки зрения выхода конечного продукта предпочтительнымподходом оказалась двукратная обработка 0,125% Triton X-114 при +30 °С.Остаточный Triton X-114 удаляли из раствора с помощью диализа (Рисунок 11).Рисунок 11. Типичная ОФ-ВЭЖХ хроматограмма обработанных TritonX-114 образцов ИЛ-36РА до диализа (пунктирная линия) и после диализа(сплошная линия).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
