Главная » Просмотр файлов » Автореферат

Автореферат (1145683), страница 4

Файл №1145683 Автореферат (Получение рекомбинантного антагониста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических свойств) 4 страницаАвтореферат (1145683) страница 42019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Пик 1’15’’ соответствует ИЛ-36РА, пик 3’10’’ соответствуетTriton X-114.Метод очистки ИЛ-36РА в масштабе лабораторного производстваТехнология получения ФС ИЛ-36РА в масштабе лабораторногопроизводства состоит из следующих стадий: культивирование штаммапродуцента, лизис биомассы, осветление лизата методом флоккуляции,негативная анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow(GE, США), гидрофобная хроматография на сорбенте Butyl-650 S (Tosoh,Япония), ультрафильтрационное концентрирование на мембране Ultracel PL-10(Merck-Millipore, США), очистка от ЛПС с помощью двухфазной системы сдетергентом Triton X-114, диализ, добавление Tween-80 до 0,01% истерилизующая фильтрация.

Выход ИЛ-36РА после всех этапов очистки19составил в среднем 51,4% (от количества ИЛ-36РА в биомассе штаммапродуцента) (Таблица 1).Таблица 1. Выход и потери ИЛ-36РА в процессе получения ФС вмасштабе лабораторного производства. Приведены усреднённые значенияизмерений от трёх последовательных экспериментов.ОбразецИЛПотери ИЛ- Количес Чистота ЛПС,36РА, г 36РА натво ИЛ- ИЛEU/мгстадии, %36РА, % 36РА, % ИЛ-36РАБиомасса штамма1,216100,0%продуцентаОсветлённый лизат1,07012%88,0%биомассыЛизат биомассы0,91015%74,8%после флоккуляцииФракция, не0,8823%72,6%31,3%связавшаяся с QФракция,0,69721%57,3%96,2%9814элюировавшаяся сButyl-650Образец после0,6901%56,7%ультрафильтрацииОбразец после Triton0,6289%51,6%X-114Образец после0,6280,0%51,6%диализаОбразец после0,6250,5%51,4%95,8 %2стерилизацииПосле завершения процедуры очистки проводили выходной контрольполученной ФС ИЛ-36РА на соответствие требованиям проекта ФСП.Результаты проведенного исследования легли в основу лабораторногорегламента получения ФС ИЛ-36РА.

Разработанная технология позволяетполучать высокоочищенный ИЛ-36РА, соответствующий требованиям проектаФСП, при единовременной обработке 240-300 г биомассы от одногокультивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА в биореакторе объёмом 10литров.20Метод очистки ИЛ-36РА в масштабе пилотного промышленногопроизводстваДальнейшее масштабирование технологии получения ИЛ-36РАпроведено при культивировании штамма-продуцента в пилотном масштабе(объём культуры 160 л, вес биомассы 3400 г).Основными этапами получения ИЛ-36РА стали лизис биомассы,осветление лизата методом кислотного фракционирования, катионообменнаяхроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow (GE, США), удаление ЛПС спомощью отмывки детергентом Triton X-114, гидрофобная хроматография насорбентеButyl-650S(Tosoh,Япония),ультрафильтрационноеконцентрирование на мембране Ultracel PL-10 (Merck-Millipore, США),добавление Tween-80 до 0,01% и стерилизующая фильтрация.

Выход ФС ИЛ36РА при получении в пилотном масштабе составил в среднем 36,8% (отколичества ИЛ-36РА в биомассе штамма-продуцента) (Таблица 2).Таблица 2. Выход и потери ИЛ-36РА в процессе хроматографическойочистки с применением катионообменной хроматографии в пилотноммасштабе. Приведены усреднённые значения измерений от трёхпоследовательных экспериментов.ОбразецКоличество ПотериКоличест Чистота ЛПС,ИЛ-36РА, г ИЛ-36РА воИЛ- ИЛEU/мгна36РА, %36РА, % ИЛстадии, %36РАБиомассаштамма4,154100%продуцентаОсветлённыйлизат биомассы3,65612%88,0%рН 7,0Осветлённыйлизат биомассы2,81523%67,8%рН 4,0Элюат с SP FF 2,28019%54,9%81,2%2рН 5,5Элюат с Butyl-6501,73324%41,7%Образец после1,54211%37,1%ультрафильтрацииОбразец после1,5271,0%36,8%96,1%4стерилизацииФизико-химические характеристики и биологическая активностьполучаемого с использованием этого метода ИЛ-36РА соответствовали21требованиям проекта ФСП и были аналогичны характеристикам ИЛ-36РА,полученного нами ранее.Результаты проведенного исследования легли в основу опытнопромышленного регламента получения ФС ИЛ-36РА.

С применениемразработанной технологии получен биологически активный ИЛ-36РА вколичестве более 50 г с чистотой более 95% по ОФ-ВЭЖХ, содержащий менее5% метиониновой и дезамидированной форм и менее 10 EU ЛПС на мг белка.Полученный препарат был использован для проведения доклиническихисследований эффективности и безопасности разрабатываемого лекарственногосредства на основе ИЛ-36РА для лечения псориаза.ЗАКЛЮЧЕНИЕПоскольку для полной биологической активности ИЛ-36РА необходимоотщепление инициаторного остатка метионина, нами разработан способполучения безметионинового ИЛ-36РА в Escherichia coli.

Создана серияплазмид, несущих ген метионинаминопептидазы (МАП) E. coli под контролемразличных промоторов, для коэкспресии ИЛ-36РА и МАП и протестировано ихвлияние на продукцию ИЛ-36РА. Наибольшая продукция ИЛ-36РА ссодержанием менее 5% непроцессированной формы с неотщеплённыминициаторным остатком метионина показана нами для штамма E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), в котором ген МАП контролировалсяиндуцируемым арабинозой промотором.

Полученный ИЛ-36РА обладалбиологической активностью, соответствующей активности ИЛ-36РА,выпускаемого фирмой R&D Systems (США). Разработанный нами способполучения ИЛ-36РА, включающая культивированиештамма E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) в биореакторах объёмом до 250 л,позволяет получить значительно большие количества целевого белка, чемметодики, предложенные ранее другими авторами (Towne et al., 2011; Günther,Sundberg, 2014).Установлено, что в процессе выделения и хранения при рН > 7.0 ИЛ36РАподвергаетсядезамидированию.Дляоценкисодержаниядезамидированной формы ИЛ-36РА в получаемом препарате разработан методанализа на основе кИЭФ.

Технология получения и хранения белкаоптимизирована для минимизации этих модификаций.Разработаны три методики хроматографической очистки ИЛ-36РА,пригодные для очистки ИЛ-36РА из биомассы культур различных объёмов.Наиболее прогрессивная из них позволяет в течение трехнедельногопроизводственного цикла получать 8-10 г высокоочищенного ИЛ-36РА.Наработанный белок использован для проведения доклиническихисследований эффективности и безопасности разрабатываемого во ФГУП«Гос.НИИ ОЧБ» лекарственного средства на основе ИЛ-36РА для лечения22тяжёлых форм псориаза. Было показано отсутствие острой токсичности в дозахдо 200 мг/кг (в 2000 раз превосходит расчётную терапевтическую дозу длячеловека), хронической токсичности (20 мг/кг 90 дней), репродуктивнойтоксичности, пирогенности, мутагенности и аллергенности.ВЫВОДЫ1.Создана и охарактеризована серия штаммов-продуцентовбезметионинового рекомбинантного ИЛ-36РА человека на основе E.

coli BL21DE3,трансформированныходнойихплазмид,несущихгенметионинаминопептидазы E. coli (map) под контролем различных промоторов,и плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА человека (IL36RN). Штамм E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) является наиболее продуктивным иобеспечивает получение ИЛ-36РА с содержанием непроцессированной формыменее 5%.2.Оптимизирована методика культивирования штамма E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) для применения в биореакторах объёмомдо 250 л, что позволяет получить до 24 г неочищенного ИЛ-36РА от одногозапуска биореактора.3.Разработаны три способа хроматографической очистки ИЛ-36РА избиомассы культур различных объёмов, которые позволяют получать препаратИЛ-36РА с чистотой более 95% по ОФ-ВЭЖХ, содержащий менее 5%дезамидированной формы и менее 10 EU ЛПС на мг белка. Наиболеепрогрессивная методика позволяет получить 8-10 г очищенного ИЛ-36РА заодин производственный цикл.4.Установлено, что ИЛ-36РА в процессе выделения и хранения прирН > 7,0 подвергается дезамидированию.

Для оценки содержаниядезамидированой формы ИЛ-36РА разработан метод анализа на основе кИЭФ.5.Подобраны условия хранения ИЛ-36РА, минимизирующиедезамидирование ИЛ-36РА. Разработан состав фармацевтической субстанцииИЛ-36РА. Образцы ФС ИЛ-36РА хранятся в растворе этого состава не менеегода без изменений своих свойств.6.Биологическая активность получаемого по разработанной методикев масштабе пилотного промышленного производства ИЛ-36РА в модельнойсистеме in vitro на основе клеток линии А549, трансфицированных плазмидой,несущей ген рецептора ИЛ-36, соответствует биологической активностикоммерческого стандартного препарата.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6390
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее