Автореферат (1145683), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Пик 1’15’’ соответствует ИЛ-36РА, пик 3’10’’ соответствуетTriton X-114.Метод очистки ИЛ-36РА в масштабе лабораторного производстваТехнология получения ФС ИЛ-36РА в масштабе лабораторногопроизводства состоит из следующих стадий: культивирование штаммапродуцента, лизис биомассы, осветление лизата методом флоккуляции,негативная анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow(GE, США), гидрофобная хроматография на сорбенте Butyl-650 S (Tosoh,Япония), ультрафильтрационное концентрирование на мембране Ultracel PL-10(Merck-Millipore, США), очистка от ЛПС с помощью двухфазной системы сдетергентом Triton X-114, диализ, добавление Tween-80 до 0,01% истерилизующая фильтрация.
Выход ИЛ-36РА после всех этапов очистки19составил в среднем 51,4% (от количества ИЛ-36РА в биомассе штаммапродуцента) (Таблица 1).Таблица 1. Выход и потери ИЛ-36РА в процессе получения ФС вмасштабе лабораторного производства. Приведены усреднённые значенияизмерений от трёх последовательных экспериментов.ОбразецИЛПотери ИЛ- Количес Чистота ЛПС,36РА, г 36РА натво ИЛ- ИЛEU/мгстадии, %36РА, % 36РА, % ИЛ-36РАБиомасса штамма1,216100,0%продуцентаОсветлённый лизат1,07012%88,0%биомассыЛизат биомассы0,91015%74,8%после флоккуляцииФракция, не0,8823%72,6%31,3%связавшаяся с QФракция,0,69721%57,3%96,2%9814элюировавшаяся сButyl-650Образец после0,6901%56,7%ультрафильтрацииОбразец после Triton0,6289%51,6%X-114Образец после0,6280,0%51,6%диализаОбразец после0,6250,5%51,4%95,8 %2стерилизацииПосле завершения процедуры очистки проводили выходной контрольполученной ФС ИЛ-36РА на соответствие требованиям проекта ФСП.Результаты проведенного исследования легли в основу лабораторногорегламента получения ФС ИЛ-36РА.
Разработанная технология позволяетполучать высокоочищенный ИЛ-36РА, соответствующий требованиям проектаФСП, при единовременной обработке 240-300 г биомассы от одногокультивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА в биореакторе объёмом 10литров.20Метод очистки ИЛ-36РА в масштабе пилотного промышленногопроизводстваДальнейшее масштабирование технологии получения ИЛ-36РАпроведено при культивировании штамма-продуцента в пилотном масштабе(объём культуры 160 л, вес биомассы 3400 г).Основными этапами получения ИЛ-36РА стали лизис биомассы,осветление лизата методом кислотного фракционирования, катионообменнаяхроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow (GE, США), удаление ЛПС спомощью отмывки детергентом Triton X-114, гидрофобная хроматография насорбентеButyl-650S(Tosoh,Япония),ультрафильтрационноеконцентрирование на мембране Ultracel PL-10 (Merck-Millipore, США),добавление Tween-80 до 0,01% и стерилизующая фильтрация.
Выход ФС ИЛ36РА при получении в пилотном масштабе составил в среднем 36,8% (отколичества ИЛ-36РА в биомассе штамма-продуцента) (Таблица 2).Таблица 2. Выход и потери ИЛ-36РА в процессе хроматографическойочистки с применением катионообменной хроматографии в пилотноммасштабе. Приведены усреднённые значения измерений от трёхпоследовательных экспериментов.ОбразецКоличество ПотериКоличест Чистота ЛПС,ИЛ-36РА, г ИЛ-36РА воИЛ- ИЛEU/мгна36РА, %36РА, % ИЛстадии, %36РАБиомассаштамма4,154100%продуцентаОсветлённыйлизат биомассы3,65612%88,0%рН 7,0Осветлённыйлизат биомассы2,81523%67,8%рН 4,0Элюат с SP FF 2,28019%54,9%81,2%2рН 5,5Элюат с Butyl-6501,73324%41,7%Образец после1,54211%37,1%ультрафильтрацииОбразец после1,5271,0%36,8%96,1%4стерилизацииФизико-химические характеристики и биологическая активностьполучаемого с использованием этого метода ИЛ-36РА соответствовали21требованиям проекта ФСП и были аналогичны характеристикам ИЛ-36РА,полученного нами ранее.Результаты проведенного исследования легли в основу опытнопромышленного регламента получения ФС ИЛ-36РА.
С применениемразработанной технологии получен биологически активный ИЛ-36РА вколичестве более 50 г с чистотой более 95% по ОФ-ВЭЖХ, содержащий менее5% метиониновой и дезамидированной форм и менее 10 EU ЛПС на мг белка.Полученный препарат был использован для проведения доклиническихисследований эффективности и безопасности разрабатываемого лекарственногосредства на основе ИЛ-36РА для лечения псориаза.ЗАКЛЮЧЕНИЕПоскольку для полной биологической активности ИЛ-36РА необходимоотщепление инициаторного остатка метионина, нами разработан способполучения безметионинового ИЛ-36РА в Escherichia coli.
Создана серияплазмид, несущих ген метионинаминопептидазы (МАП) E. coli под контролемразличных промоторов, для коэкспресии ИЛ-36РА и МАП и протестировано ихвлияние на продукцию ИЛ-36РА. Наибольшая продукция ИЛ-36РА ссодержанием менее 5% непроцессированной формы с неотщеплённыминициаторным остатком метионина показана нами для штамма E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), в котором ген МАП контролировалсяиндуцируемым арабинозой промотором.
Полученный ИЛ-36РА обладалбиологической активностью, соответствующей активности ИЛ-36РА,выпускаемого фирмой R&D Systems (США). Разработанный нами способполучения ИЛ-36РА, включающая культивированиештамма E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) в биореакторах объёмом до 250 л,позволяет получить значительно большие количества целевого белка, чемметодики, предложенные ранее другими авторами (Towne et al., 2011; Günther,Sundberg, 2014).Установлено, что в процессе выделения и хранения при рН > 7.0 ИЛ36РАподвергаетсядезамидированию.Дляоценкисодержаниядезамидированной формы ИЛ-36РА в получаемом препарате разработан методанализа на основе кИЭФ.
Технология получения и хранения белкаоптимизирована для минимизации этих модификаций.Разработаны три методики хроматографической очистки ИЛ-36РА,пригодные для очистки ИЛ-36РА из биомассы культур различных объёмов.Наиболее прогрессивная из них позволяет в течение трехнедельногопроизводственного цикла получать 8-10 г высокоочищенного ИЛ-36РА.Наработанный белок использован для проведения доклиническихисследований эффективности и безопасности разрабатываемого во ФГУП«Гос.НИИ ОЧБ» лекарственного средства на основе ИЛ-36РА для лечения22тяжёлых форм псориаза. Было показано отсутствие острой токсичности в дозахдо 200 мг/кг (в 2000 раз превосходит расчётную терапевтическую дозу длячеловека), хронической токсичности (20 мг/кг 90 дней), репродуктивнойтоксичности, пирогенности, мутагенности и аллергенности.ВЫВОДЫ1.Создана и охарактеризована серия штаммов-продуцентовбезметионинового рекомбинантного ИЛ-36РА человека на основе E.
coli BL21DE3,трансформированныходнойихплазмид,несущихгенметионинаминопептидазы E. coli (map) под контролем различных промоторов,и плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА человека (IL36RN). Штамм E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) является наиболее продуктивным иобеспечивает получение ИЛ-36РА с содержанием непроцессированной формыменее 5%.2.Оптимизирована методика культивирования штамма E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) для применения в биореакторах объёмомдо 250 л, что позволяет получить до 24 г неочищенного ИЛ-36РА от одногозапуска биореактора.3.Разработаны три способа хроматографической очистки ИЛ-36РА избиомассы культур различных объёмов, которые позволяют получать препаратИЛ-36РА с чистотой более 95% по ОФ-ВЭЖХ, содержащий менее 5%дезамидированной формы и менее 10 EU ЛПС на мг белка. Наиболеепрогрессивная методика позволяет получить 8-10 г очищенного ИЛ-36РА заодин производственный цикл.4.Установлено, что ИЛ-36РА в процессе выделения и хранения прирН > 7,0 подвергается дезамидированию.
Для оценки содержаниядезамидированой формы ИЛ-36РА разработан метод анализа на основе кИЭФ.5.Подобраны условия хранения ИЛ-36РА, минимизирующиедезамидирование ИЛ-36РА. Разработан состав фармацевтической субстанцииИЛ-36РА. Образцы ФС ИЛ-36РА хранятся в растворе этого состава не менеегода без изменений своих свойств.6.Биологическая активность получаемого по разработанной методикев масштабе пилотного промышленного производства ИЛ-36РА в модельнойсистеме in vitro на основе клеток линии А549, трансфицированных плазмидой,несущей ген рецептора ИЛ-36, соответствует биологической активностикоммерческого стандартного препарата.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
