Автореферат (1145683), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Соискатель приноситсоавторам и коллегам свою искреннюю благодарность.Структура и объём диссертацииДиссертация состоит из введения, обзора литературы, описанияматериалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов исписка литературы. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста,иллюстрирована 58 рисунками, 5 таблицами и 1 приложением. Списоклитературы содержит 177 литературных источников.7МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫСоздание штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РАОптимизированная по кодонному составу последовательность мРНК генаIL36RN, кодирующего ИЛ-36РА человека, была клонирована в плазмидныйвектор рЕТ22b+.
Полученный вектор получил название pET-IL36Raf.Последовательность мРНК гена map, кодирующего метионинаминопептидазу(МАП) E. coli, была клонирована в плазмидный вектор pACYC184. Получилитри плазмидных вектора, несущих ген МАП под контролем трёх различныхпромоторов – T7/lac, rhaBAD, araBAD. Полученные плазмиды далееобозначены как pET15A, pRh15A, pBAD15A, соответственно. Правильностьнуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов былаподтверждена с помощью секвенирования.
Бактерии E. coli BL21 DE3 былитрансформированы плазмидой pET-IL36Raf и одной из плазмид, несущих генМАП.Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РАВ колбах штаммы-продуценты ИЛ-36РА культивировали в 1,5-кратнойсреде LB с 100 мкг/л ампициллина и 25 мкг/л хлорамфеникола. 10 мл культурырастили 16 часов при +37 °С, затем инокулировали в 200 мл среды доплотности 0,3 ОЕ/мл и растили при +37 °C до плотности 3 ОЕ/мл. После этоготемпературу понижали до +30 °С и вносили индукторы: 0,5 мМ ИПТГ, а такжев зависимости от штамма 0,02% рамнозы или 0,2% арабинозы.
Длительностьиндукции составляла 3 часа.В биореакторах BIOFLO-110 (NewBrunswick, США) объёмом 1 и 10литров культивировали штамм E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A).Предварительную культуру растили 18 часов при +37 °С в 1,5-кратной средеLB с 100 мкг/л ампициллина и 25 мкг/л хлорамфеникола, дополненной 1кратной средой M9. В сосуде ферментёра культивирование проводили в такойже среде при рН 7,0±0,1. По исчерпанию в среде глюкозы вводили питательнуюдобавку, содержащую гидролизат казеина и дрожжевой экстракт, понижалитемпературу до +30 °С и вносили ИПТГ до 0,5 мМ и арабинозу до 20 г/л. Затемкаждый час вносили дополнительно 8 г/л арабинозы.
Длительность индукциисоставляла 3 часа.Культивирование в биореакторе объёмом 250 л (рабочий объём культуры160 л) проведено сотрудниками ИБФМ РАН по аналогичной методике.Лизис биомассы штаммов-продуцентов ИЛ-36РА и осветлениелизатовБиомассу лизировали путем замораживания и размораживания,ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl буфере рН 7,0 и перемешивали 30-60минут. Дебрис удаляли центрифугированием.На этапе культивирования штаммов-продуцентов ИЛ-36РА вферментерах 1 и 10 л лизат дополнительно осветляли методом флоккуляции.
К8раствору добавляли KH2PO4 до 20 мМ и CaCl2 до 30 мМ, инкубировали 1 час.Осадок удаляли центрифугированием.На этапе культивирования штамма в ферментере 250 л лизатдополнительно осветляли методом кислотного фракционирования. К лизатудобавляли 50% уксусную кислоту до достижения рН 4,0. Осадок удалялицентрифугированием.Очистка растворов от ЛПС с помощью обработки Triton X-114Для очистки ИЛ-36РА от ЛПС применяли метод разделения фаз сдетергентом Triton X-114. К образцу добавляли Triton X-114 до 0,125%,инкубировали 30 минут на ледяной бане и 5-15 минут при +30 °С допомутнения раствора.
Фракцию мицелл Triton X-114, содержащую ЛПС,отделяли центрифугированием. Протокол повторяли 2 раза. Остаточнуюпримесь Triton X-114 удаляли с помощью диализа.Анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow(GE, США)Сорбцию примесных белков, нуклеиновых кислот и липополисахаридовпроводили в 50 мМ трис-HCl, pH 7,0. Колонку промывали 50 мМ трис-HCl,15мM NaCl, pH 7,0. Соединяли несвязавшуюся фракцию с промывочной ииспользовали для дальнейшей очистки ИЛ-36РА.Катионообменная хроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow(GE, США)ИЛ-36РА сорбировали в 50 мМ трис-ацетатном буфере, pH 4,0.
Колонкупромывали тем же буфером. ЛПС удаляли промывкой 1% Triton X-114 в том жебуфере, затем 1% Tween-80 в том же буфере, затем снова тем же буфером.Элюцию ИЛ-36РА проводили в 50 мМ трис-ацетатном буфере, pH 5,5.Гидрофобная хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650S(Tosoh, Япония)К пробе, полученной на предыдущем этапе очистки, добавляли сульфатаммония до 150 мМ и сорбировали ИЛ-36РА из этого раствора. Колонкупромывали 50 мМ фосфатом натрия с 150 мМ сульфата аммония, pH 6,0.Элюцию ИЛ-36РА проводили либо апирогенной водой, либо 50 мМ фосфатомнатрия, pH 6,0.Оценка биологической активности ИЛ-36РАБиологическую активность ИЛ-36РА in vitro оценивали по способностиблокировать связывание ИЛ-36g с рецептором ИЛ-36 на поверхности клетокА549+36R (клетки линии А549, трансфицированные плазмидой, несущей генрецептора ИЛ-36 человека) и ингибировать продукцию ими ИЛ-8.Концентрацию ИЛ-8 определяли методом ИФА (Цитокин, Россия).Биологическую активность ИЛ-36РА in vivo оценивали по способностикупировать воспаление в модели псориазоподобного дерматита на мышах.9Работасживотнымипроводиласьсотрудникамилабораторииэкспериментальной фармакологии и токсикологии ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» подруководством Г.В.
Александрова.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕВыполненная работа проводилась в рамках проекта лабораториииммунофармакологии ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России по разработкелекарственного средства на основе рекомбинантного рецепторного антагонистаинтерлейкина-36 (ИЛ-36РА) человека для лечения псориаза.
Главная цельпроведенного исследования состояла в разработке технологии полученияфармацевтической субстанции ИЛ-36РА и исследовании биологических ифизико-химических свойств этого белка.Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА на основеE.coli BL21[DE3]Поскольку ИЛ-36РА не имеет сайтов гликозилирования, рекомбинантныйИЛ-36РА получали в E. coli. Сначала был получен штамм-продуцент ИЛ-36РАчеловека, E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf), содержащий плазмиду pET-IL36Raf,несущую последовательность нативного ИЛ-36РА под контролем промоторафага Т7.Оказалось, что ИЛ-36РА, получаемый от этого штамма-продуцента,содержит до 60% непроцессированной формы белка с N-концевыминициаторным остатком метионина (далее - метиониновая форма).
Посколькуметиониновая форма ИЛ-36РА не обладает биологической активностью (Towneet al. 2011), возникла необходимость разработки способа полученияпроцессированного безметионинового ИЛ-36РА.Быласозданасерияштаммов-продуцентовИЛ-36РА,трансформированных двумя плазмидами pET-IL36Raf и плазмидой, несущейген метионинаминопептидазы (МАП) E. coli. Для этого получена серияплазмид, несущих ген МАП под контролем промоторов различной силы: T7/lac,активируемого ИПТГ или лактозой (плазмида pET15A); rhaBAD,активируемого рамнозой (плазмида pBAD15A); araBAD, активируемогоарабинозой (плазмида pRh15A).
Ими и плазмидой pET-IL36Rafтрансформированы бактерии штамма E. coli BL21 [DE3]. Штаммы получилиназвания E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A), E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf)(pBAD15A)иE.coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A),соответственно.После оптимизации условий индукции совместной экспрессии генов,кодирующих МАП и ИЛ-36РА, проведено сравнение продуктивности этихштаммов и эффективности отщепления N-концевого метионина от ИЛ-36РА.Штамм-продуцент ИЛ-36РА, не несущий плазмиды с геном МАП, производил10ИЛ-36РА, содержащий в среднем 26% непроцессированной формы цитокина(Рисунки 1, 2). Все три штамма-продуцента, коэкспрессирующие гены ИЛ36РА и МАП, производили ИЛ-36РА, содержащий менее 3%непроцессированной формы (Рисунки 1, 2).Рисунок 1.
Наложение типичных ОФ-ВЭЖХ хроматограмм образцов ИЛ36РА, полученных при коэкспрессии с МАП (сплошная кривая) и безкоэкспрессии с МАП (пунктирная кривая).Рисунок 2. Сравнение количества непроцесированной формы ИЛ-36РА впрепаратах ИЛ-36РА, полученных от различных штаммов-продуцентов E. coli.36RA – штамм, трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ36РА;36RA/MAP-ara,36RA/MAP-lac,36RA/MAP-rha–штаммы,трансформированные плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущейген МАП под контролем различных промоторов: ara (промотор araBAD), rha(промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7). * р < 0,05 (t-критерий Стьюдента,отмечена ошибка среднего (SEM).11Выбор наиболее продуктивного штамма-продуцента безметиониновогоИЛ-36РАНаибольшую продукцию ИЛ-36РА среди штаммов, способныхпроизводить безметиониновый ИЛ-36РА, обеспечил штамм E.
coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) (Рисунок 3). Его продуктивностьдостоверно не отличается от продуктивности штамма E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf), не несущего плазмиды с геном МАП.Рисунок 3. Сравнение продукции ИЛ-36РА различными штаммамипродуцентами E.
coli. 36RA – штамм, трансформированный только плазмидой,несущей ген ИЛ-36РА; 36RA/MAP-ara, 36RA/MAP-lac, 36RA/MAP-rha –штаммы, трансформированные плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой,несущей ген МАП под контролем различных промоторов: ara (промоторaraBAD), rha (промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7). * р < 0,05 (t-критерийСтьюдента) , отмечена ошибка среднего (SEM).Биологическая активность образцов ИЛ-36РА, полученных от всехштаммов с коэкспрессией МАП, составила 100%, тогда как активность образцаИЛ-36РА с содержанием 58% метиониновой формы от штамма E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf), не имеющего плазмиды с геном МАП E.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
