Главная » Просмотр файлов » Автореферат

Автореферат (1145683), страница 2

Файл №1145683 Автореферат (Получение рекомбинантного антагониста рецептора интерлейкина 36 человека и изучение его физико-химических и биологических свойств) 2 страницаАвтореферат (1145683) страница 22019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Соискатель приноситсоавторам и коллегам свою искреннюю благодарность.Структура и объём диссертацииДиссертация состоит из введения, обзора литературы, описанияматериалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов исписка литературы. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста,иллюстрирована 58 рисунками, 5 таблицами и 1 приложением. Списоклитературы содержит 177 литературных источников.7МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫСоздание штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РАОптимизированная по кодонному составу последовательность мРНК генаIL36RN, кодирующего ИЛ-36РА человека, была клонирована в плазмидныйвектор рЕТ22b+.

Полученный вектор получил название pET-IL36Raf.Последовательность мРНК гена map, кодирующего метионинаминопептидазу(МАП) E. coli, была клонирована в плазмидный вектор pACYC184. Получилитри плазмидных вектора, несущих ген МАП под контролем трёх различныхпромоторов – T7/lac, rhaBAD, araBAD. Полученные плазмиды далееобозначены как pET15A, pRh15A, pBAD15A, соответственно. Правильностьнуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов былаподтверждена с помощью секвенирования.

Бактерии E. coli BL21 DE3 былитрансформированы плазмидой pET-IL36Raf и одной из плазмид, несущих генМАП.Культивирование штаммов-продуцентов ИЛ-36РАВ колбах штаммы-продуценты ИЛ-36РА культивировали в 1,5-кратнойсреде LB с 100 мкг/л ампициллина и 25 мкг/л хлорамфеникола. 10 мл культурырастили 16 часов при +37 °С, затем инокулировали в 200 мл среды доплотности 0,3 ОЕ/мл и растили при +37 °C до плотности 3 ОЕ/мл. После этоготемпературу понижали до +30 °С и вносили индукторы: 0,5 мМ ИПТГ, а такжев зависимости от штамма 0,02% рамнозы или 0,2% арабинозы.

Длительностьиндукции составляла 3 часа.В биореакторах BIOFLO-110 (NewBrunswick, США) объёмом 1 и 10литров культивировали штамм E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A).Предварительную культуру растили 18 часов при +37 °С в 1,5-кратной средеLB с 100 мкг/л ампициллина и 25 мкг/л хлорамфеникола, дополненной 1кратной средой M9. В сосуде ферментёра культивирование проводили в такойже среде при рН 7,0±0,1. По исчерпанию в среде глюкозы вводили питательнуюдобавку, содержащую гидролизат казеина и дрожжевой экстракт, понижалитемпературу до +30 °С и вносили ИПТГ до 0,5 мМ и арабинозу до 20 г/л. Затемкаждый час вносили дополнительно 8 г/л арабинозы.

Длительность индукциисоставляла 3 часа.Культивирование в биореакторе объёмом 250 л (рабочий объём культуры160 л) проведено сотрудниками ИБФМ РАН по аналогичной методике.Лизис биомассы штаммов-продуцентов ИЛ-36РА и осветлениелизатовБиомассу лизировали путем замораживания и размораживания,ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl буфере рН 7,0 и перемешивали 30-60минут. Дебрис удаляли центрифугированием.На этапе культивирования штаммов-продуцентов ИЛ-36РА вферментерах 1 и 10 л лизат дополнительно осветляли методом флоккуляции.

К8раствору добавляли KH2PO4 до 20 мМ и CaCl2 до 30 мМ, инкубировали 1 час.Осадок удаляли центрифугированием.На этапе культивирования штамма в ферментере 250 л лизатдополнительно осветляли методом кислотного фракционирования. К лизатудобавляли 50% уксусную кислоту до достижения рН 4,0. Осадок удалялицентрифугированием.Очистка растворов от ЛПС с помощью обработки Triton X-114Для очистки ИЛ-36РА от ЛПС применяли метод разделения фаз сдетергентом Triton X-114. К образцу добавляли Triton X-114 до 0,125%,инкубировали 30 минут на ледяной бане и 5-15 минут при +30 °С допомутнения раствора.

Фракцию мицелл Triton X-114, содержащую ЛПС,отделяли центрифугированием. Протокол повторяли 2 раза. Остаточнуюпримесь Triton X-114 удаляли с помощью диализа.Анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow(GE, США)Сорбцию примесных белков, нуклеиновых кислот и липополисахаридовпроводили в 50 мМ трис-HCl, pH 7,0. Колонку промывали 50 мМ трис-HCl,15мM NaCl, pH 7,0. Соединяли несвязавшуюся фракцию с промывочной ииспользовали для дальнейшей очистки ИЛ-36РА.Катионообменная хроматография на сорбенте SP Sepharose Fast Flow(GE, США)ИЛ-36РА сорбировали в 50 мМ трис-ацетатном буфере, pH 4,0.

Колонкупромывали тем же буфером. ЛПС удаляли промывкой 1% Triton X-114 в том жебуфере, затем 1% Tween-80 в том же буфере, затем снова тем же буфером.Элюцию ИЛ-36РА проводили в 50 мМ трис-ацетатном буфере, pH 5,5.Гидрофобная хроматография на сорбенте Toyopearl Butyl-650S(Tosoh, Япония)К пробе, полученной на предыдущем этапе очистки, добавляли сульфатаммония до 150 мМ и сорбировали ИЛ-36РА из этого раствора. Колонкупромывали 50 мМ фосфатом натрия с 150 мМ сульфата аммония, pH 6,0.Элюцию ИЛ-36РА проводили либо апирогенной водой, либо 50 мМ фосфатомнатрия, pH 6,0.Оценка биологической активности ИЛ-36РАБиологическую активность ИЛ-36РА in vitro оценивали по способностиблокировать связывание ИЛ-36g с рецептором ИЛ-36 на поверхности клетокА549+36R (клетки линии А549, трансфицированные плазмидой, несущей генрецептора ИЛ-36 человека) и ингибировать продукцию ими ИЛ-8.Концентрацию ИЛ-8 определяли методом ИФА (Цитокин, Россия).Биологическую активность ИЛ-36РА in vivo оценивали по способностикупировать воспаление в модели псориазоподобного дерматита на мышах.9Работасживотнымипроводиласьсотрудникамилабораторииэкспериментальной фармакологии и токсикологии ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» подруководством Г.В.

Александрова.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕВыполненная работа проводилась в рамках проекта лабораториииммунофармакологии ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России по разработкелекарственного средства на основе рекомбинантного рецепторного антагонистаинтерлейкина-36 (ИЛ-36РА) человека для лечения псориаза.

Главная цельпроведенного исследования состояла в разработке технологии полученияфармацевтической субстанции ИЛ-36РА и исследовании биологических ифизико-химических свойств этого белка.Получение штаммов-продуцентов безметионинового ИЛ-36РА на основеE.coli BL21[DE3]Поскольку ИЛ-36РА не имеет сайтов гликозилирования, рекомбинантныйИЛ-36РА получали в E. coli. Сначала был получен штамм-продуцент ИЛ-36РАчеловека, E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf), содержащий плазмиду pET-IL36Raf,несущую последовательность нативного ИЛ-36РА под контролем промоторафага Т7.Оказалось, что ИЛ-36РА, получаемый от этого штамма-продуцента,содержит до 60% непроцессированной формы белка с N-концевыминициаторным остатком метионина (далее - метиониновая форма).

Посколькуметиониновая форма ИЛ-36РА не обладает биологической активностью (Towneet al. 2011), возникла необходимость разработки способа полученияпроцессированного безметионинового ИЛ-36РА.Быласозданасерияштаммов-продуцентовИЛ-36РА,трансформированных двумя плазмидами pET-IL36Raf и плазмидой, несущейген метионинаминопептидазы (МАП) E. coli. Для этого получена серияплазмид, несущих ген МАП под контролем промоторов различной силы: T7/lac,активируемого ИПТГ или лактозой (плазмида pET15A); rhaBAD,активируемого рамнозой (плазмида pBAD15A); araBAD, активируемогоарабинозой (плазмида pRh15A).

Ими и плазмидой pET-IL36Rafтрансформированы бактерии штамма E. coli BL21 [DE3]. Штаммы получилиназвания E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pET15A), E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf)(pBAD15A)иE.coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A),соответственно.После оптимизации условий индукции совместной экспрессии генов,кодирующих МАП и ИЛ-36РА, проведено сравнение продуктивности этихштаммов и эффективности отщепления N-концевого метионина от ИЛ-36РА.Штамм-продуцент ИЛ-36РА, не несущий плазмиды с геном МАП, производил10ИЛ-36РА, содержащий в среднем 26% непроцессированной формы цитокина(Рисунки 1, 2). Все три штамма-продуцента, коэкспрессирующие гены ИЛ36РА и МАП, производили ИЛ-36РА, содержащий менее 3%непроцессированной формы (Рисунки 1, 2).Рисунок 1.

Наложение типичных ОФ-ВЭЖХ хроматограмм образцов ИЛ36РА, полученных при коэкспрессии с МАП (сплошная кривая) и безкоэкспрессии с МАП (пунктирная кривая).Рисунок 2. Сравнение количества непроцесированной формы ИЛ-36РА впрепаратах ИЛ-36РА, полученных от различных штаммов-продуцентов E. coli.36RA – штамм, трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ36РА;36RA/MAP-ara,36RA/MAP-lac,36RA/MAP-rha–штаммы,трансформированные плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущейген МАП под контролем различных промоторов: ara (промотор araBAD), rha(промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7). * р < 0,05 (t-критерий Стьюдента,отмечена ошибка среднего (SEM).11Выбор наиболее продуктивного штамма-продуцента безметиониновогоИЛ-36РАНаибольшую продукцию ИЛ-36РА среди штаммов, способныхпроизводить безметиониновый ИЛ-36РА, обеспечил штамм E.

coliBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A) (Рисунок 3). Его продуктивностьдостоверно не отличается от продуктивности штамма E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf), не несущего плазмиды с геном МАП.Рисунок 3. Сравнение продукции ИЛ-36РА различными штаммамипродуцентами E.

coli. 36RA – штамм, трансформированный только плазмидой,несущей ген ИЛ-36РА; 36RA/MAP-ara, 36RA/MAP-lac, 36RA/MAP-rha –штаммы, трансформированные плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой,несущей ген МАП под контролем различных промоторов: ara (промоторaraBAD), rha (промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7). * р < 0,05 (t-критерийСтьюдента) , отмечена ошибка среднего (SEM).Биологическая активность образцов ИЛ-36РА, полученных от всехштаммов с коэкспрессией МАП, составила 100%, тогда как активность образцаИЛ-36РА с содержанием 58% метиониновой формы от штамма E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf), не имеющего плазмиды с геном МАП E.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6384
Авторов
на СтудИзбе
308
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее