Диссертация (1145685), страница 30
Текст из файла (страница 30)
coli на 1 мг белка (СДНК) по формуле:C ДНК CДНК/мл Сб ,(12)где: Сб – концентрация белка в субстанции (мг/мл).Бактериальные эндотоксины. Не более 10 ЕЭ на 1 мг белка (ГФ ХIII,ОФС.1.2.4.0006.15).Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичным (ГФ ХIII, ОФС.1.2.4.0004.15).Тест-доза 5,0 мг рецепторного антагониста интерлейкина-36 (0,5 мл субстанции безразведения), внутрибрюшинно.Стерильность. Должен быть стерильным (ГФ ХIII, ОФС.1.2.4.0003.15). Определяютметодом прямого посева.Количественное определение.
Рецепторный антагонист интерлейкина-36. Не менее10,0мг/мл.Определяютспектрофотометрическимметодомультрафиолетовой и видимой областях, ГФ ХIII, ОФС.1.2.1.1.0003.15).(спектрофотометрияв166Приготовление цитратного буферного раствора. В пробирку вместимостью 15 млпомещают 1,0 мг полисорбата-80, 3,36 мг динатрия эдетата, 147 мг натрия цитрата, с помощьюавтоматической пипетки добавляют 10 мл воды для инъекций, перемешивают до полногорастворения компонентов.Проведение измерений.150 мкл субстанции помещают в кювету спектрофотометра с толщиной слоя 1 см,добавляют 2,85 мл цитратного буферного раствора, кювету закрывают крышкой, содержимоеперемешивают 10-кратным переворачиванием и определяют оптическую плотность раствора придлине волны 280 нм (D280).
В качестве контроля используют цитратный буферный раствор.Концентрацию рецепторного антагониста интерлейкина-36 (С, мг/мл) в субстанции вычисляют поформуле:Cгде:D280 20,,1%A10см(13)D280оптическаяплотность испытуемого раствора субстанции, о.е./мл;А0,1%1смкоэффициентудельного поглощения рецепторного антагонистаинтерлейкина-36,равныйоптическойплотностирастворасконцентрацией 1 мг/мл при 280 нм - 1,43 о.е./мг;20коэффициентразведения субстанции.Измерение повторяют три раза и результат усредняют.Специфическая активность. Должен достоверно подавлять продукцию интерлейкина-8клетками линии А-549/IL36R+, вызванную 10 нг/мл интерлейкина-36, в концентрации не более12 нг/мл.
Определение проводят биологическим методом.Специфическую активность рецепторного антагониста интерлейкина-36 оцениваютпутем определения способности препарата отменять продукцию ИЛ-8 в культуре клеток А549/IL36R+, стимулированных ИЛ-36 гамма.Приготовление маточного раствора ИЛ-36 гаммаВо флакон, содержащий 10 мкг рекомбинантного ИЛ-366835-IL, R&D Systems, США,стерильно добавляют 1,0 мл среды DMEM (1.3.5, Биолот, Россия) с 1% фетальной телячьейсыворотки (ФТС) (1.1.12, Биолот, Россия). Полученный раствор концентрации 10 мкг/млаликвотируют по 25 мкл в микроцентрифужные пробирки. Хранят при температуре – 70 °С втечение 6 месяцев.167Культивирование клеток линии A-549/IL36R+.
Клетки культивируют в культуральныхфлаконах с площадью поверхности 75 см2 в 20 мл среды DMEM, содержащей 10% ФТС и 0,5мкг/мл пуромицина гидрохлорида. Для снятия клеток с пластика используют раствор ТрипсинаВерсена (1:1) (1.2.8, Биолот, Россия). Клетки пересевают каждые 4 дня.
Посевная дозасоставляет 1 млн клеток на флакон. Для теста клетки могут быть использованы на 3 или 4 суткипосле очередного пересева.Подготовка клеточной культуры -549/IL36R+ для проведения теста. Из флакона скультурой A-549/IL36R+ на 3 или 4 сутки после очередного пересева сливают культуральнуюсреду, однократно промывают монослой 10 мл подогретой до +37 °С средой DMEM и затемснимают клетки с пластика 10 мл раствора Трипсина-Версена (1:1) (1.2.8, Биолот, Россия).Суспензию клеток переносят в 15-мл пробирку, центрифугируют при 200 g 10 мин.
Осадокресуспендируют в 5 мл среды DMEM и подсчитывают клеточность и жизнеспособность (поокраске трипановым синим) в камере Горяева под инвертированным микроскопом. Далееготовят взвесь клеток в среде DMEM с 10% ФТС с концентрацией 4х105 клеток на миллилитр ипереносят по 100 мкл на лунку в плоскодонный планшет для культивирования клеток (5598,Corning, США) из расчета 5 рядов по 8 лунок для анализа одного образца субстанции. Планшетпомещают на сутки в СО2-инкубатор при +37 °С, 5% СО2.Приготовление рабочего раствора ИЛ-36К 20 мкл маточного раствора ИЛ-36прибавляют 4980 мкл среды DMEM с 1% ФТС, получая раствор с концентраций 40 нг/мл. Сучетом разведения в 4 раза в тесте конечная концентрация ИЛ-36 будет составлять 10 нг/мл.Раствор используют свежеприготовленным.Приготовление разведений исследуемого образца субстанции ИЛ-36РА. Разведенияисследуемого образца субстанции готовят таким образом, чтобы их конечные концентрации втесте составляли от 3 мкг/мл до 4 нг/мл (семь последовательных разведений с шагом 3).
Сучетом разведения в 4 раза в тесте первое разведение готовится с концентрацией 12 мкг/мл. Дляэтого к 10 мкл исследуемой субстанции с концентрацией 10 мг/мл добавляют 990 мкл средыDMEM с 1% ФТС, получая раствор с концентрацией 100 мкг/мл. Дальнейшие разведениясубстанции готовят в круглодонном планшете для культивирования клеток (5799, Corning,США). В первую лунку планшета добавляют 39,6 мкл приготовленного раствора субстанцииИЛ-36РА с концентрацией 100 мкг/мл и 290 мкл среды DMEM с 1% ФТС, а в следующие шестьлунок по 220 мкл среды среды DMEM с 1% ФТС.
Из первой лунки переносят во вторую 110мкл раствора, перемешивают. Затем в следующих пяти лунках готовят аналогичным образом168еще пять последовательных трехкратных разведений субстанции ИЛ-36РА. Растворыисследуемой субстанции готовят непосредственно перед использованием.96-луночный плоскодонный планшет с культурой А-549/IL36R+ для постановки теставынимают из СО2-инкубатора и оценивают плотность и равномерность монослоя в лунках подинвертированным микроскопом.
Клетки во всех лунках должны образовать плотныйравномерный монослой. Далее всю среду из лунок с клетками аккуратно отбирают, стараясь неповредить монослой и вносят по 100 мкл свежей среды DMEM с 10% ФТС.Затем в лунки с клетками вносят по 50 мкл приготовленных ранее разведенийисследуемого образца субстанции ИЛ-36РА, причем каждое разведений вносят не менее чем вчетыре лунки планшета. Затем во все лунки планшета добавляют по 50 мкл приготовленногорабочего раствора ИЛ-36. Одновременно в этом же планшете ставят необходимые контроли:- не менее чем в 4 лунки добавляют 50 мкл среды DMEM с 1% ФТС и 50 мклприготовленного рабочего раствора ИЛ-36 (контроль действия ИЛ-36).- не менее чем в 8 лунок добавляют 100 мкл среды DMEM с 1% ФТС для определенияспонтанного уровня продукции ИЛ-8 культурой клеток.Культуральный планшет возвращают в СО2-инкубатор на 20-24 часа. После окончаниявремени инкубации планшет вынимают из СО2-инкубатор и определяют концентрацию ИЛ-8 всупернатантах с помощью набора для иммуноферментного анализа ИНТЕРЛЕЙКИН-8-ИФАБЕСТ (Вектор-Бест, Россия) по инструкции изготовителя.
Все супернатанты предварительноразводят в 20 раз буфером для разведения образцов из набора. После расчета концентрации ИЛ8 в супернатантах полученные значения умножают на 20, чтобы учесть это разведение.Данные по концентрации ИЛ-8 в параллельных лунках усредняют. Достоверностьотличий рассчитывают с помощью непарного Т-теста Стъюдента с неравными отклонениями,используя программу Excel (Microsoft, США). Отличия считаются достоверными при значенияхвероятности Т-теста (р) меньших 0,05.Тестсчитаетсяудовлетворительным,еслиспонтаннаяпродукцияИЛ-8всоответствующих контрольных лунках составляет не более 500 пг/мл, а в лунках контролядействия ИЛ-36 концентрация ИЛ-8 больше, чем спонтанная продукция не менее чем в 5 раз.Для оценки специфической активности субстанции ИЛ-36РА производят расчетдостоверности различий продукции ИЛ-8 клетками A-549/IL36R+ в присутствии различныхконцентраций анализируемого образца субстанции от уровня ИЛ-8 в лунках контроля действия169ИЛ-36.
Препарат считается активным, если минимальная концентрация ИЛ-36РА, при которойпродукция ИЛ-8 достоверно снижается, составляет не более 12 нг/мл.Упаковка.Первичная упаковка. 10 или 20 мл в бутылке стеклянной для крови, трансфузионных иинфузионных препаратов по ГОСТ 10782-85, укупоренной пробкой из резины марок ИР-21,25 П или 52-369/1 по ТУ 38.006269-95 или ТУ 38.106618-95 и обжатой колпачкомалюминиевым по ГОСТ Р 51314-99 или в пластиковой бутылке из перфторированногосополимера этиленпропилена марки Teflon FEP (Nalgene, США), укупоренной навинчиваемойкрышкой из сополимера этилентетрафторэтилена марки Tefzel ETFE (Sigma-Aldrich, Германия).На каждую бутылку наклеивают этикетку из бумаги писчей по ГОСТ 18510-87 илиэтикеточной по ГОСТ 7625-86 или самоклеящуюся на бумажной основе из ленты клеевой поГОСТ 18251-87 или по ТУ 9571-001-20806751-2003. 1 бутылку помещают в пачку из картонакоробочного по ГОСТ 7933-89 или из картона хром-эрзац мелованного по ТУ 13-0281020-97-90или картона хром-эрзац макулатурного мелованного по ТУ ОП 5453-011-04766356-00.Групповая упаковка и транспортная тара в соответствии с ГОСТ 17768-90.Маркировка.На этикетке бутылки указывают:название субстанции, концентрацию в мг/мл, сокращенное наименование предприятияизготовителя и его товарный знак, «субстанция», назначение, объем в мл, номер серии, датуизготовления, срок годности, условия хранения.На этикетке групповой упаковки дополнительно указывают количество пачек.Транспортирование.
СП 3.3.2.1248-03, при температуре от 2 до 8 °С. Допускаетсятранспортирование при температуре от 2 до 25 °С в течение 5 сут.Хранение. СП 3.3.2.1248-03. При температуре от 2 до 8 °С.Срок годности. 1 год.Назначение. Для изготовления стерильных лекарственных средств.Примечание.Реактивы,приведенныевнастоящей фармакопейной статье предприятия, описанывсоответствующихФармакопеи ХIII издания.разделахГосударственной.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
