Диссертация (1145685), страница 29
Текст из файла (страница 29)
Объемзаполнения – 700 мкл для рабочих растворов и 300 мкл для слива. Перед установкой пробиркицентрифугируют в течение 5 мин при 5000 g.Кассету с установленным покрытым капилляром длиной 45 см и внутренним диаметром50 мкм помещают в систему капиллярного электрофореза Капель-105М (Люмэкс, Россия), приэтом концы капилляра не должны находиться на воздухе более пяти минут и должны бытьнемедленно помещены в деионизированную воду.В начале каждого дня в прибор устанавливают рабочие растворы и проводяткондиционирование капилляра. Для этого осуществляют последовательные промывкикапилляра деионизованной водой (4 мин, 2000 мбар), химическим мобилизатором (4 мин, 2000мбар), деионизованной водой (1 мин, 2000 мбар), гелем для кИЭФ (8 мин, 2000 мбар).
Во времявсех этапов осуществляется термостатирование капилляра при температуре 20 °С и детекция надлине волны 205 нм.Проведение капиллярного изоэлектрического фокусирования161Перед введением пробы капилляр промывается раствором 4,3 М мочевины (4 мин, 2000мбар), затем деионизованной водой (4 мин, 2000 мбар). Образцы вводят при давлении 2000мбар в течение 2 мин с последующим погружением входного и выходного электрода в воду.Фокусировка проводится раствором анолита на входном конце и католита на выходном концекапилляра при напряжении 25 кВ в течение 20 минут.
Затем для химической мобилизации навыходекапилляраустанавливаетсяпробиркасуксуснойкислотой(химическиммобилизатором) и подается напряжение 25 кВ в течение 60 минут, после чего капиллярпромывается деионизованной водой (5 мин, 2000 мбар). Во время всех этапов осуществляетсятермостатирование капилляра при температуре 20 °С и детекция на длине волны 280 нм.Обработка результатовНа полученных во время этапа мобилизации электрофореграммах отмечают пики,соответствующиепроизводитсяпептиднымавтоматическимаркерамвиизоформампрограммеЭльфоранбелка.Интегрирование(Люмэкс,Россия).пиковРасчетизоэлектрических точек белков осуществляется по уравнению, полученному методом линейнойрегрессии по зависимости изоэлектрических точек пептидных маркеров от времени ихмиграции. Отмечают пики, соответствующие нативной форме ИЛ-36РА (pI = 5,23±0,03) идезамидированной форме белка (pI =5,060,03).Содержание примеси дезамидированной формы в процентах от содержания основноговещества (Х) вычисляют по формуле:X где:SдехS дез 100,S нат S дез(5)площадьпика дезамидированной формы на хроматограммеиспытуемого раствора;Sнатплощадьпика нативной формы на хроматограмме испытуемогораствора;100пересчетв процентыБелок клеток-продуцентов.
Не более 100 нг на 1 мг белка. Определяют методомтвердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческой тест-системы E.сoli HCP ELISA kit (F410, Cygnus Technologies, США).162Перед постановкой теста все компоненты набора выдерживают при комнатнойтемпературе в течение 1 ч.Приготовлениепромывочногобуферногораствора.Концентратпромывочногобуферного раствора из набора переносят в мерную колбу и доводят объем водой до 1 л,перемешивают. Срок годности буферного раствора соответствует сроку годности набора прихранении при температуре 2-8 °С.Постановка тестаДля постановки теста готовят необходимое количество стрипов с иммобилизованнымиантителами к белкам клеток E. сoli.
При анализе от одного до двух образцов необходимо двастрипа, от трех до шести образцов – три стрипа и т.д. Нужное количество стриповустанавливают в рамке, остальные убирают в пакет и плотно закрывают.Вносят по 100 мкл конъюгата козьих антител к белкам E.coli с пероксидазой хрена изнабора во все лунки стрипов.Далее вносят в лунки по 50 мкл стандартных растворов из набора с концентрациямиантигена 0, 1, 3, 12, 40 и 100 нг/мл в дубликатах, а также исследуемые образцы субстанции по50 мкл в дубликатах.Накрывают рамку со стрипами крышкой и инкубируют 2 ч при комнатной температурена шейкере (около 600 об/мин).После окончания инкубации тщательно промывают лунки стрипов промывочнымбуферным раствором (не менее 350 мкл на лунку) 4 раза. Удаляют остатки буферного раствораиз лунок аккуратным постукиванием перевернутой рамкой со стрипами по фильтровальнойбумаге.
Не допускают высыхания стрипов до следующего этапа.Вносят во все лунки по 100 мкл субстрата TMБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин) изнабора. Инкубируют стрипы 30 мин при комнатной температуре. Вносят во все стрипы по 100мкл Стоп-раствора (0,5М серная кислота) из набора. Определяют оптическую плотность влунках при длине волны 450 нм с помощью планшетного ридера Victor 2 (Wallac, США) илианалогичного.Учет результатовЗначения оптических плотностей в параллельных лунках усредняют. С использованиемпрограммы Excel (Microsoft, США) или другой строят калибровочную кривую зависимостиоптической плотности в лунках со стандартными растворами от концентрации антигена.163Анализируя линейный участок кривой, строят линию тренда линейного типа и находят ееформулу, которая имеет вид:Y kX b(6)Далее подставляют усредненное значение оптической плотности (D) в лунках, кудавносился образец субстанции, в уравнение вместо Y и определяют содержание примесей белкаклеток-продуцентов в нг/мл (Сhcp/мл) по формуле:Chcp / мл ( D b) k(7)Затем рассчитывают содержание примесей белка клеток-продуцентов (Сhcp.) в нг/мг ИЛ36РА по формуле:Chcp Сhcp / млСб(8)где Сб – концентрация белка в субстанции.ДНК клеток-продуцентов.
Не более 2 нг на 1 мг белка. Определяют с помощьюполимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием коммерческогонабора E.coli Host Cell DNA Extraction & Amplification Kit in Tubes (D410T, CygnusTechnologies, США).Приготовление 0,5 М раствора трилона Б. 18,6 г трилона Б растворяют в 80 мл воды,устанавливают потенциометрически рН 8,0 с помощью 30 % раствора натрия гидроксида,доводят объем водой до 100 мл, перемешивают. Срок годности раствора 1 мес при температуре2-8 °С.Приготовление TE буферного раствора.
0,121 г трис(гидроксиметил)аминометанапомещают в мерную колбу или стакан вместимостью 100 мл, добавляют 0,2 мл 0,5 М растворатрилона Б с рН 8,0 и доводят водой до метки, перемешивают. Срок годности раствора 1 мес притемпературе 2-8 °С.Приготовление рабочего раствора протеиназы К. 3 мкл концентрата протеиназы К изнабора переносят в микроцентрифужную пробирку, добавляют 27 мкл ТЕ буферного раствора.Перемешивают встряхиванием. Раствор используют свежеприготовленным.Экстракция ДНК из исследуемого образца. Помещают 125 мкл исследуемой субстанциив микропробирку объемом 2 мл, добавляют 375 мкл раствора для разбавления ДНК (из набора)164и 25 мкл рабочего раствора протеиназы К. Перемешивают на вортексе и инкубируют 30 минпри температуре 60 °С в твердотельном термостате.
Затем центрифугируют микропробирку 1мин при 10000 g.Вносят по 500 мкл стандартных растворов ДНК клеток E. coli из набора (концентрации0, 0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 100.0 пг/10 мкл) в микроцентрифужные пробирки объемом 2 мл.Добавляют по 500 мкл буферного раствора для экстракции из набора в микропробирки сисследуемым образцом и стандартными растворами. Перемешивают каждую микропробирку навортексе в течение 5 сек. Добавляют в каждую микропробирку по 1 мл буферного раствора дляпреципитации из набора.
Перемешивают каждую микропробирку на вортексе в течение 5 сек иинкубируют при комнатной температуре 5 мин. Центрифугируют микропробирки 10 мин при10000 g.Сливают супернатант из микропробирок и постукиванием по фильтровальной бумагеудаляют остатки супернатанта.
Добавляют в каждую микропробирку по 1,5 мл буферногораствора для промывания ДНК и перемешивают на вортексе 5 сек. Инкубируют при комнатнойтемпературе 20 мин, за это время 2 раза перемешивают микропробирки на вортексе.Центрифугируют микропробирки 5 мин при 10000 g. Сливают супернатант из микропробирок ипостукиванием по фильтровальной бумаге удаляют остатки супернатанта.Ресуспендируют осадки в 250 мкл ТЕ буферного раствора, подогретого до 50 °С.Перемешивают микропробирки на вортексе, инкубируют 5 мин при комнатной температуре иповторно перемешивают.Постановка полимеразной цепной реакции в реальном времениСмешивают 62,5 мкл смеси праймеров из набора и 312,5 мкл реагента Power SYBR®Green PCR Master Mix (4367659, Thermo Fisher Scientific, США) в чистой микропробирке.Вносят по 15 мкл полученной смеси в 21 лунку планшета для ПЦР в реальном времени изнабора.
Далее вносят в лунки по 10 мкл экстрагированных стандартных и исследуемыхобразцов (по три лунки для каждого образца). Заклеивают планшет входящей в набор пленкой.Слабым постукиванием по краю планшета удаляют пузырьки воздуха со дна лунок. Помещаютпланшет в амплификатор iQ5 (Bio-Rad, США) или аналогичный и проводят амплификацию спараметрами: 1 цикл – 10 мин при 95 °С; 35 циклов – 15 сек при 95 °С и 1 мин при 61 °С; метка– SYBR.Расчет концентрации ДНК в исследуемой субстанции165Значения Сt, полученные при амплификации параллельных образцов, усредняют и сиспользованиемпрограммыExcel(Microsoft,США)строяткалибровочнуюкривуюзависимости Сt от концентрации ДНК в стандартных образцах. Определяют формулу линиитренда линейного типа для калибровочной кривой, которая имеет вид:Y kX b(9)Далее по обратной формуле из усредненного значения Ctобр, полученного дляисследуемого образца субстанции, определяют концентрацию ДНК клеток E.coli в экстрактеЭсубстанции ( C ДНК ) в пг/10 мкл:ЭC ДНК (Ctобр b) k(10)Затем определяют уровень примеси ДНК клеток E.coli в 1 мл субстанции (СДНК/мл) внг/мл по формуле:ЭC ДНК / мл CДНК 4 100,(11)где: 4 – разведение при экстрагировании ДНК из субстанции;100 – коэффициент пересчета из пг/10 мкл в нг/мл.Далее рассчитывают содержание примеси ДНК E.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
