Диссертация (1145685), страница 28

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 28)

При необходимости рН раствора доводят до нужногозначения 1 М раствором кислоты хлористоводородной или 1 М раствором натрия гидроксида.Срок годности растворов 4 дня при температуре 4-6 °С.Проверка пригодности хроматографической системыХроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующиеусловия:– относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площади основного пика наосновании 6 введений раствора (1) составляет не более 5,0 % (ГФ XI, вып.1, с.199);– эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по основному пику (раствор 1),должна быть не менее 1500 теоретических тарелок (ГФ XI, вып.1, с.105);Эффективность хроматографической колонки вычисляют по формуле:2 t N  5,545  ,W (1)где: t – время удерживания основного пика, мин;W – ширина пика у основания, мин.Коэффициент асимметрии пика, рассчитанный по пику интерлейкина-7 (раствор 1)должен быть не более 3,0.Коэффициент асимметрии пика (Т) вычисляют по формуле:T где:а-W0,052a,(2)расстояние от начала пика на высоте 5 % от базовой линии доперпендикуляра, проведенного из его вершины, в мм;156W0,05 -ширина пика на высоте 5 % от базовой линии, в мм.0,1 мл препарата разбавляют в 20 раз буферным раствором для хроматографии в мернойколбе вместимостью 10 мл (раствор с концентрацией 0,5 мг/мл).40 мкл полученного раствора анализируют на хроматографе высокого давления HP1O9O M (Hewlett Packard, США) или аналогичного типа с УФ-детектором, получая не менее 5хроматограмм в следующих условиях:-Колонка Superdex 75 10/30 GL (GE, США);-детекция при длине волны 220 нм (с интегратором или комплектом для компьютернойобработки результатов хроматографии);-скорость потока подвижной фазы – 0,75 мл/мин;-подвижная фаза: 0,2 М аммония сульфат, 50 мМ натрия фосфат с рН 6,5 (буферный раствордля хроматографии);-время детекции – 30 мин;-температура колонки – 20 оС;-масштаб регистрации – 0,05 единиц оптической плотности.-время удерживания пика рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36около 20 мин;-обработка результатов анализа – с помощью интегратора или подходящей компьютернойпрограммы.Суммарное содержание посторонних, неидентифицированных примесей или единичнойпримеси в процентах от содержания основного вещества (Х) вычисляют по формуле:Xгде:Sx Sx 100,Sa   S x(3)сумма- площадей минорных пиков или площадь пика единичнойпримеси на хроматограмме испытуемого раствора;Sаплощадь-основногопиканахроматограммеиспытуемогораствора;100пересчетв процентыРезультаты анализа считаются достоверными, если выполняются требования теста «Проверкапригодности хроматографической системы».1572.

Суммарное содержание посторонних примесей не должно превышать 5 %.Определениепроводятметодомобращенно-фазнойвысокоэффективнойжидкостнойхроматографии (ОФ-ВЭЖХ).Хроматографическое исследование образцов проводят на хроматографе высокогодавления НР-1050 с DAD детектором (Hewlett-Packard, СШA) или аналогичном хроматографе,имеющем градиентную систему подачи элюента, термостат для колонки, УФ-детектор исистему сбора и обработки данных (интегратор или компьютер с соответствующимпрограммным обеспечением).Приготовление буферного раствора А. В конической колбе вместимостью 1 л на весахвзвешивают 699,0 г воды, 300 мл ацетонитрила с учетом плотности 0,782 г/мл, добавляют1,0 мл трифторуксусной кислоты.

Перемешивают и дегазируют любым удобным способом.Хранят в плотно укупоренном флаконе при температуре 18-25 °С. Срок годности раствора 7сут.Приготовление буферного раствора В. В конической колбе вместимостью 1 л на весахвзвешивают 299,0 г воды, 700 мл ацетонитрила с учетом плотности 0,782 г/мл, добавляют1,0 мл трифторуксусной кислоты. Перемешивают и дегазируют любым удобным способом.Хранят в плотно укупоренном флаконе при температуре 18-25 °С. Срок годности раствора 7сут.Приготовление рабочего раствора определяемого вещества. Концентрация рабочегораствора исследуемого образца должна быть не менее 1,25 мг/мл, т.е.

не менее 25 мкгрекомбинантного ИЛ-36РА человека на введение в объеме, не превышающем 0,02 мл. Дляприготовления рабочего раствора исследуемый образец субстанции разбавляют в 8 раз. Дляэтого в пробирку типа эппендорф помещают 25 мкл исследуемого образца и 175 мкл воды.Приготовление образцов для калибровки (стандартных образцов). В качествекалибровочного (стандартного) образца используют раствор рабочего стандартного образца(РСО) с концентрацией не менее 1,0 мг/мл.Уравновешивают хроматографическую колонку буферным раствором А минимум втечение 15 мин с помощью перистальтического насоса.Хроматографию растворов стандартного образца и испытуемого образца субстанциипроводят в следующих условиях:158- колонка Jupiter, 5 мкм, 300 А (Phenomenex), или аналогичная колонка из нержавеющейстали, длиной 0,25 м и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная силикагелем С18 дляхроматографии (диаметр частиц 5 мкм, размер пор 300 А);- детектирование на УФ-детекторе при длине волны 220 нм;- температура колонки – 35 °С;- скорость потока подвижной фазы 1,5 мл/мин;- объем вводимой пробы 20 мкл;- масштаб регистрации – 0,5 единиц оптической плотности;- время анализа – 20 мин;- градиент – 30-70 % ацетонитрила за 20 мин (от 100% буферного раствора А до 100%буферного раствора B).-обработка результатов анализа – с помощью интегратора или подходящей компьютернойпрограммы.Сравнивают хроматограммы раствора стандартного образца и раствора испытуемогопрепарата по количеству пиков и временам их удерживания.Суммарное содержание посторонних примесей в процентах от содержания основноговещества (Х) вычисляют по формуле:XГде:Sx Sx 100,Sa   S x(4)сумма- площадей минорных пиков на хроматограмме испытуемогораствора;Sаплощадьосновного пика на хроматограмме испытуемого раствора100пересчетв процентыРодственные примеси.

Содержание дезамидированной формы с pI (5,060,05) не должнопревышать 5 %. Определяют методом капиллярного изоэлектрического фокусирования(кИЭФ).Исследование проводят с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель105М», или аналогичной, с возможностью детекции на длине волны 280 нм и системойобработкирезультатов,предусматривающейинтегрированиепиков.Изоэлектрическое159фокусирование проводится в капилляре с нейтральным покрытием eCAPTM (Beckman-Coulter,США). Все растворы готовят на деионизированной воде.Приготовление анодного электродного раствора – анолита. В пробирку объемом 15 млналивают 7 мл деионизированной воды, затем добавляют 137 мкл 85% фосфорной кислоты идоводят объем водой до 10 мл. Раствор перемешивают и хранят при комнатной температуре втечение 30 дней.Приготовление катодного электродного раствора – католита.

В пробирку объемом 15мл наливают 7 мл воды, затем при перемешивании и охлаждении добавляют 0,12 г натриягидроксида, растворяют и доводят объем водой до 10 мл. Хранят при комнатной температуре втечение 30 дней.Приготовление химического мобилизатора. В пробирку объемом 15 мл наливают 7 млдеионизированной воды, затем добавляют 200 мкл ледяной уксусной кислоты и доводят объемводой до 10 мл. Раствор перемешивают и хранят при комнатной температуре в течение 30 дней.Приготовление катодного стабилизатора.

43,5 мг L-аргинина помещают в пробиркутипа Эппендорф, добавляют 300 мкл воды и перемешивают до полного растворения. Затемобъем доводят водой до 500 мкл, перемешивают и хранятпри комнатной температуре втечение 30 дней.Приготовление анодного стабилизатора. 13,5 мг иминодиуксусной кислоты помещаютв пробирку типа Эппендорф, добавляют 300 мкл воды и перемешивают до полногорастворения. Затем объем доводят водой до 500 мкл, перемешивают и хранят при комнатнойтемпературе в течение 30 дней.Приготовление 4,3 М раствора мочевины. 2,6 г мочевины помещают в пробиркуобъемом 15 мл, добавляют 5 мл воды и перемешивают до полного растворения.

Затем объемдоводят водой до 10 мл, перемешивают и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм.Раствор хранят при температуре 2-8°С в течение 30 дней.Приготовление геля для кИЭФ, содержащего 3 М мочевину. 0,5 г мочевины помещают впробирку объемом 15 мл, добавляют 1,5 мл геля для кИЭФ (Beckman Coulter) и перемешиваютдо полного растворения. Затем добавляют гель для кИЭФ до объема 2,75 мл, перемешивают ифильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Раствор хранят при температуре 2-8°С втечение 30 дней.Приготовление 20 мМ трис-буфера рН 8.0. В пробирке объемом 15 мл растворяют 24 мгтрис(гидроксиметил)аминометана в 9 мл деионизованной воды, доводят рН буфера160концентрированной соляной кислотой до 8, затем объем раствора доводят водой до 10 мл иперемешивают.

Раствор хранят при температуре 2-8°С в течение 30 дней.Обессоливание образца субстанции. Раствор белка объемом до 500 мкл наносят наультрафильтрационнуюспин-колонкуAmiconUltra-0.5(Merck-Millipore,США)ицентрифугируют при 14000g в течение 7 минут. Затем фильтрат удаляют, в колонку добавляютраствор 20 мМ трис-буфера рН 8.0 до конечного объема 500 мкл и повторяютцентрифугирование. Замену буфера проводят дважды.Приготовление пробы для кИЭФ. Для приготовления пробы в пробирку объемом 1,5 млдобавляют 100 мкл геля для кИЭФ, содержащего 3 М мочевину, 6 мкл амфолитов Pharmalyte 310, 10 мкл катодного стабилизатора, 1 мкл анодного стабилизатора, по 0,5 мкл каждогопептидного маркера и 5 мкл обессоленного образца субстанции.

Пробу перемешивают ицентрифугируют в течение 5 минут при 5000g.Подготовка капилляра к проведению капиллярного изоэлектрического фокусированияВ начале каждого дня проводят предварительную подготовку капилляра к проведениюкапиллярного изоэлектрического фокусирования. После выполнения анализов в конце дняосуществляют подготовку капилляра к хранению.Для всех растворов, устанавливающихся в систему капиллярного электрофореза,используют пробирки типа Эппендорф объемом 1,5 мл с удаленными крышками.

Характеристики

Список файлов диссертации