Диссертация (1145685), страница 27
Текст из файла (страница 27)
Прозрачная или слегка опалесцирующая бесцветная жидкость.151Подлинность. Определяют четырьмя методами: биологический (1), электрофорез вПААГ (2), ОФ-ВЭЖХ (3), кИЭФ (4).1. Должен достоверно подавлять продукцию интерлейкина-8 клетками линии А549/IL36R+, вызванную интерлейкином-36 гамма. Определяют биологическим методом поразделу «Специфическая активность».2. На электрофореграмме должна быть одна полоса рецепторного антагонистаинтерлейкина-36 с кажущейся молекулярной массой (17000±500) Да. Определяют методомэлектрофореза в полиакриламидном геле (градиент 4-20 %) в присутствии додецилсульфатанатрия в восстанавливающих условиях.Электрофорез выполняют на приборе типа BioRad, Mini-Protean Tetra Cell, используянабор стандартных белков с молекулярной массой от 14400 до 116000 Да (Thermo FisherScientific, кат. №26610).
Полимеризацию геля проводят между пластинами из стекла вспециальном приспособлении для заливки геля, входящем в комплект прибора илианалогичном в соответствии с инструкцией к прибору.Приготовление 30 % раствора акриламида/бисакриламида. 29,2 г акриламида («Серва»,кат. № 10675 или аналогичного качества) и 0,8 г N,N’-метиленбисакриламида («Серва», кат. №29195 или аналогичного качества) помещают в химический стакан вместимостью 100 мл,растворяют в 70 мл воды при перемешивании. Раствор фильтруют через фильтр типа «SyringеFilter NY» с размером пор 0,45 мкм (Corning, кат.
№431225) и хранят в закрытом флаконетемного стекла при температуре 4-6 °С в течение 1 мес.Приготовление 1,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора рН 8,8. 9,08 г трис(оксиметил)аминометана («Серва», кат. № 37190 или аналогичного качества) помещают вмерный химический стакан вместимостью 100 мл, растворяют при перемешивании в 40 млводыипотенциометрическихлористоводороднойдоводятконцентрированной.рНраствораОбъемрастворадозначениядоводят8,8водойкислотойдо50 мл,перемешивают.
Раствор фильтруют через фильтр типа «Syringе Filter NY» с размером пор 0,45мкм (Corning, кат.№ 431225,) и хранят при температуре 4-6 °С в течение 3 мес в закрытомфлаконе.Приготовление 0,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора рН 6,8. 3,03 г трис(оксиметил)аминометана помещают в мерный химический стакан вместимостью 100 мл ирастворяют при перемешивании в 40 мл воды, потенциометрически доводят рН раствора дозначения 6,8 кислотой хлористоводоводородной концентрированной. Объем раствора доводят152водой до 50 мл и перемешивают. Раствор фильтруют через фильтр типа Syring Filter NY сразмером пор 0,45 мкм (Corning, кат. № 431225) и хранят при температуре 4-6 °С в течение 3мес в закрытом флаконе.Приготовление 10 % раствора натрия додецилсульфата (ДСН).
10,0 г натриядодецил сульфата («Серва», кат. № 20760 или аналогичного качества) помещают в мерныйхимический стакан вместимостью 100 мл, добавляют 90 мл воды и перемешивают до полногорастворения. Хранят при температуре 18-25 °С.Приготовление 10 % раствора аммония персульфата (ПСА). 100 мг аммонияперсульфата («Серва»,кат. № 13375 или аналогичного качества) помещают во флаконвместимостью 2-5 мл, растворяют в 1,0 мл воды при перемешивании встряхиванием. Растворготовят непосредственно перед использованием.Приготовление электродного буферного раствора.
Используют буферный рабочийраствор для электрофореза в системе натрия додецилсульфат - полиакриламидный гель (ГФXII,ч.1, с.334). Хранят при температуре 4-6 °С в течение 6 мес.Приготовление раствора для приготовления образца. В пробирку вместимостью 10 млпомещают 2,5 мл 0,5 Мраствора ДСН, 2,0 млтрис-гидрохлоридного буферного раствора рН 6,8, 4,0 мл 10 %глицерина, 1,0 мл β-меркаптоэтанола (Sigma, кат.
№ М 7154 илианалогичного качества), 0,5 мл воды и 4,0 мг бромфенолового синего, тщательноперемешивают. Срок годности раствора 2 недели при температуре 18-25 °С.Приготовление раствора концентрирующего геля. В пробирку вместимостью 10 мл спомощью автоматических микропипеток с переменным объемом помещают 0,76 мл воды, 0,31мл 0,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора с pH 6,8, 0,17 мл 30 % раствораакриламида/бисакриламида, 0,012 мл 10 % раствора ДСН, 0,006 мл 10 % раствора ПСА, 0,001мл тетраметил-этилендиамина (ТЕМЕД, «Серва», кат.
№ 35925 или аналогичного качества) итщательно перемешивают. Раствор готовят непосредственно перед использованием.Приготовление раствора исследуемого препарата. 10 мкл образца исследуемойсубстанции помещают в пробирку типа Эппендорф, добавляют 90 мкл дистиллированной воды,100 мкл раствора для приготовления образца, выдерживают в твердотельном термостате притемпературе 70° в течение 10 мин и охлаждают до температуры 18-25 °С. Раствор готовятнепосредственно перед использованием.Заливка геля. Градиентный смеситель (Amersham Biosciences, кат. № 18-1013-72 илиподобный) устанавливают на магнитной мешалке, ячейку с выходным отверстием соединяют153шлангом с перистальтическим насосом, соединение между ячейками перекрывают.
В ячейкубез выходного отверстия с помощью автоматических микропипеток с переменным объемомпомещают 0,325 мл 30 % раствора акриламид/бисакриламида, 0,625 мл 1,5 М трисгидрохлоридного буферного раствора pH 8,8, 1,525 мл воды, 0,025 мл 10 % раствора ДСН,тщательно перемешивают («легкий» раствор - 4% Т, 2,7 % С).В ячейку с выходным отверстием с помощью автоматических микропипеток спеременным объемом помещают 1,65 мл 30 % раствора акриламида/бисакриламида, 0,625 мл1,5 М трис-гидрохлоридного буферного раствора pH 8,8, 0,175 мл воды и 0,025 мл 10 %раствора ДСН («тяжелый» раствор – 20 % Т, 2,7 % С). Полученный раствор тщательноперемешивают на магнитной мешалке, помещая в ячейку магнит для перемешивания.Растворы готовят непосредственно перед использованием.
В каждую ячейку добавляютпо 0,025 мл 10 % раствора персульфата аммония и 0,002 мл ТЕМЕД («Серва», кат. № 35925 илианалогичного качества), включают насос и открывают соединение между ячейками.Заливкурастворовмеждустекламиустановкиосуществляютспомощьюперистальтического насоса со скоростью около 25 мл/ч при постоянном перемешивании вячейке с «тяжелым» раствором. Затем с помощью шприца (ТУ 64-1-378-83 или аналогичный)сверху аккуратно наслаивают 100 мкл изопропанола.
Время полимеризации 10-15 мин притемпературе 18-20 °С. После окончания процесса полимеризации, о чем свидетельствуетпоявление четкой границы раздела между слоями изопропанола и геля, изопропанол сливаютчерез край, поверхность геля тщательно просушивают с помощью фильтровальной бумаги.Потом между стеклами при помощи шприца заливают раствор концентрирующего геля ивставляют гребенку с 10 зубьями толщиной, равной толщине прокладок (1,00 мм). Времяполимеризации 10-15 мин при температуре 18-20 °С.Проведение электрофорезаШтатив вынимают из столика для заливки геля и устанавливают в ячейке с электродами,которую затем помещают в ванну. Ванну и ячейку заливают электродным буферным растворомтаким образом, чтобы он был выше слоя геля на 0,5-0,6 см.
Затем вынимают гребенку изконцентрирующего геля. Образцы исследуемого препарата наносят в объеме 5 мкл на дорожку,раствор стандартных белков – также 5 мкл на дорожку. Все образцы наслаиваются на дно лунокпод слой электродного буферного раствора с помощью микрошприца (Hamilton илианалогичного).154Сразу после нанесения образцов ванну закрывают крышкой и подключают электроды кисточнику питания. На источнике питания устанавливают напряжение 200 В. Процессзаканчивают, когда лидирующий краситель достигнет нижней границы стекол.
Длительностьэлектрофореза (45 5) мин. По окончании процесса отключают источник питания, разбираютэлектрофоретическую установку и освобождают гель.Гель переносят в ванночку с чистой дистиллированной водой на 15 минут. Затем водусливают и заливают гель коммерческим окрашивающим раствором PageBlue Protein StainingSolution (Thermo Fisher Scientific, кат.№24620) объемом около 15 мл и выдерживают в течение60 мин. Затем гель трехкратно отмывают чистой дистиллированной водой. Объем воды дляодной отмывки около 30 мл, продолжительность отмывки 1 - 2 мин.После отмывки геля строят градуировочную зависимость длины пробега полосы отдесятичного логарифма молекулярной массы маркерных белков, по которой определяюткажущуюся молекулярную массу исследуемого образца.3.
Время удерживания основного пика на хроматограмме раствора субстанции должносоответствоватьвремени удерживания основного пика рабочего стандартного образца.Определяют методом ОФ-ВЭЖХ по разделу «Посторонние примеси».4. Изоэлектрическая точка основной формы белка должна быть (5,230,05). Определяютметодом капиллярного изоэлектрического фокусирования (кИЭФ) по разделу «Родственныепримеси».Прозрачность. Должен быть прозрачным по сравнению с водой или выдерживатьсравнение с эталоном сравнения I (ГФ ХIII, ОФС.1.2.1.007.15).Цветность. Должен быть бесцветным (ГФ ХIII, ОФС.1.2.1.006.15).рН. От 6,0 до 6,5 (ГФ ХIII, ОФС.
1.2.1.0004.15, потенциометрически).Посторонние примеси. Определяют двумя методами: ВЭЖХ (1), ОФ-ВЭЖХ (2).1. Суммарное содержание посторонних, неидентифицированных примесей не должнопревышать 5 %, содержание единичной неидентифицированной примеси – не более 2,5 % отплощади основного пика. Определение проводят методом эксклюзионной высокоэффективнойжидкостной хроматографии (ВЭЖХ).Приготовление буферного раствора для хроматографии:155а) приготовление 0,2 М раствора динатрия гидрофосфата (раствор А). 71,8 г динатриягидрофосфата вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют около 700 мл воды,растворяют и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают.б) приготовление 0,2 М раствора натрия дигидрофосфата (раствор В).
31,2 г натриядигидрофосфата вносят в мерную колбу вместимостью 1 л, добавляют около 700 мл воды,растворяют и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают.в) в мерную колбу вместимостью 1 л вносят 130 мл раствора А, 120 мл раствора В и навескуаммония сульфата в количестве 26,4 г, растворяют при перемешивании. Затем доводят объемраствора водой до метки, перемешивают. Значение рН полученного раствора должно быть 6,5 0,1 (контролируют потенциометрически).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
