Диссертация (1145685), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Однако нам не удалось найти в литературе примеров такого её применения.70Двухплазмидная система очень удобна тем, что её можно быстро адаптировать к любомуновому объекту, избегая дополнительных усилий с клонированием. Достаточно клонироватьген белка интереса в одну экспрессионную плазмиду и затем котрансформировать штаммноситель ею и одной из плазмид, несущих ген МАП. Таким образом, полученную нами сериюплазмид с геном МАП под контролем различных промоторов можно использовать для быстрогоподбора оптимальных условий работы МАП на новых объектах.4.1.4.
Изучение биологической активности ИЛ-36РА4.1.4.1.СравнениебиологическойактивностиИЛ-36РАотразличныхштаммов-продуцентовДля определения биологической активности полученных образцов ИЛ-36РА былаиспользована модельная система, основанная на использовании клеток аденокарциномылегочного эпителия линии А-549, стабильно трансфицированной плазмидой, несущей генрецептора ИЛ-36 человека. Эти клетки способны дозозависимо отвечать выработкой ИЛ-8 наобработку ИЛ-36, концентрация ИЛ-8 оценивается методом ИФА. ИЛ-36РА способен отменятьэтот эффект.Было проведено сравнение биологической активности образцов ИЛ-36РА, полученныхот штаммов-продуцентов E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A), E. coli BL21[DE3](pETIL36Raf)(pET15A), E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf)(pRh15A) и E.
coli BL21[DE3](pET-IL36Raf).Для всех штаммов, кроме E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf), сравнивали активность ИЛ-36РА отпоследовательных культивирований. В случае же E. coli BL21[DE3](pET-IL36Raf) примесьнепроцессированной формы ИЛ-36РА оказалась разной в образцах от разных культивирований,поэтому был взят один образец ИЛ-36РА с 58% непроцессированной формы.
В качествестандартного образца использовали коммерческий препарат рекомбинантного ИЛ-36РАчеловека (1275-IL-025, R&D Systems, США).Показано, что активность образцов ИЛ-36РА, полученных от всех штаммов скоэкспрессией МАР, составляет 100%, тогда как образец ИЛ 36РА от штамма E. coliBL21[DE3](pET-IL36Raf), не имеющего плазмиды с геном метионинаминопептидазы E. coli,составляет 44% от активности стандартного образца (Рисунок 19, 20). Эти данныесоответствуют литературным данным о том, что непроцессированная форма ИЛ-36РА,имеющая неотщеплённый N-концевой остаток метионина, не обладает биологическойактивностью [134].71Рисунок 19.
Продукция ИЛ-8 клетками линии А549+36R на фоне 10 нг/мл ИЛ-36g иразличных концентраций рекомбинантных ИЛ-36РА человека от различных штаммовпродуцентов. Использовались следующие рабочие концентрации ИЛ-36РА (округлено доцелых чисел): 3000, 1000, 333, 111, 37, 12, 4, 0. 36RA – штамм, трансформированный толькоплазмидой, несущей ген ИЛ-36РА; 36RA/MAP-ara – штамм, трансформированный плазмидой,несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущей ген МАП под контролем промотора araBAD.Вертикальными планками отмечены стандартные отклонения (SD).Рисунок 20. Биологическая активность ИЛ-36РА от различных штаммов-продуцентов E.coli.
36RA – штамм, трансформированный только плазмидой, несущей ген ИЛ-36РА;36RA/MAP-ara, 36RA/MAP-lac, 36RA/MAP-rha – штаммы, трансформированные плазмидой,несущей ген ИЛ-36РА, и плазмидой, несущей ген МАП под контролем различных промоторов:ara (промотор araBAD), rha (промотор rhaBAD), lac (промотор lac/T7); стандарт – коммерческийИЛ-36РА (1275-IL-025, R&DSystems, США). Биологическую активность всех образцовсравнивали со стандартом; звездочка – достоверные отличия от стандарта, р< 0.05 (t-критерийСтьюдента). Вертикальными планками отмечены стандартные отклонения (SD).72ДлядальнейшегомасштабногоBL21[DE3](pET-IL36Raf)(pBAD15A)культивированиякакнаиболеебылвыбранпродуктивныйиштаммE.coliобеспечивающийэффективный процессинг ИЛ-36РА.4.1.4.2.Биологическая активность ИЛ-36РА в модели псориазоподобногодерматита на мышахПоскольку конечной целью проекта было создание лекарства от псориаза на основе ИЛ36РА требовалось подтверждение активности получаемого ИЛ-36РА в релевантных модельныхсистемах in vivo.
Биологическую активность ИЛ-36РА in vivo определяли как способностьподавлять воспаление кожи в модели псориазоподобного дерматита на мышах. Работа сживотными проводилась сотрудниками лаборатории экспериментальной фармакологии итоксикологии ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» под руководством Г.В. Александрова.Дляработывыбралинаиболеепопулярнуювнастоящеевремямодельпсориазоподобного дерматита на мышах с применением агониста Толл-подобных рецепторов 7и 8 – имихимода [39, 78].
Содержащий имихимод крем Алдара наносили на кожу правого ухамышей в дозе 62,5 мкг на мышь/сутки в течение 7 дней. В качестве контрольной группыиспользовали интактных животных.ИЛ-36РА вводили животным параллельно с нанесением препарата Алдара ежедневно вдозах10 мкг/мышь (50 мкг/кг) и 50 мкг/мышь (250 мкг/кг) в 200 мкл стерильного забуференногофизиологического раствора (ЗФР) подкожно в область холки. Помимо контрольной группы вкаждом эксперименте была сформирована группа животных, получавших референсныйпрепарат – метотрексат, одобренный для клинического применения при терапии тяжелых формпсориаза у человека.
Метотрексат использовали в дозе 20 мкг/мышь, которую вводилиежедневно внутрижелудочно через зонд в 300 мкл физиологического раствора. Экспериментповторяли дважды. В обоих экспериментах ежедневно проводили морфометрическоеисследование толщины уха и визуальную оценку поражения кожи в месте нанесения препаратас последующим расчетом индекса PASI (Psoriasis Area and Severity Index, Индекс площади итяжести псориатического поражения) [73].Анализ изменения индексов PASI, рассчитанных для всех групп животных в течениеэксперимента, показал, что степень выраженности псориазоподобного дерматита былазначительно снижена в группах, получавших изучаемый препарат рекомбинантного ИЛ-36РАчеловека в дозах 50 и 10 мкг/мышь, а также метотрексат в дозе 20 мкг/мышь в сутки, по73сравнению с таковойв контрольной группе, начиная с 3-го дня и на протяжении всегоэксперимента (Рисунок 21, 22А).
Морфометрическое исследование толщины уха показало, чтов группе, получавшей исследуемый препарат в дозе 50 мкг/мышь, индекс изменения толщиныуха был достоверно ниже по сравнению с контрольной группой, начиная с 3-го дня и до концаэксперимента. В группе животных, получавших метотрексат, этот показатель достоверноснижался только на 6-й и 7-й дни эксперимента (Рисунок 22Б).АБРисунок 21. Уши мышей дикого типа после пяти дней обработки индуктором Toll-likeрецепторов имихимидом на фоне введения подкожно в холку физиологического раствора (А) иИЛ-36РА (Б).74АБРисунок 22. А. Изменение индекса PASI в опытных и контрольной группах (*р<0,01 посравнению с соответствующими значениями контрольной группы).
По оси ординат – степеньвыраженности признаков псориазоподобного дерматита в баллах PASI. Б. Изменение толщиныуха в месте нанесения имихимода в опытных и контрольной группах (* р < 0,05 по сравнению ссоответствующими значениями контрольной группы). По оси ординат – индекс изменениятолщины уха в месте нанесения имихимодаТаким образом, проведенное исследование биологической активности полученныхобразцов рекомбинантного ИЛ-36РА в модельных системах in vitro и in vivo подтвердило, что75она соответствует активности референс-препарата и что ИЛ-36РА может быть использован вкачестве активного фармацевтического ингредиента при создании нового лекарственногосредства для терапии псориаза.4.1.5. Масштабирование культивирования штамма-продуцента безметиониновогоИЛ-36РАОсновной задачей данного этапа работы стало масштабирование процесса полученияИЛ-36РА при культивировании штамма-продуцента в условиях автоматического ферментера ссохранением физико-химических и биологических свойств получаемого белка.Для дальнейшего использования был выбран штамм E.
coli BL21[DE3](pETIL36Raf)(pBAD15A), как наиболее продуктивный.В условиях 1-литрового сосуда биореактора «BIOFLO-110» (NewBrunswick, США) былиспользован разработанный протокол культивирования ИЛ-36РА в колбах, оптимизированыважнейшие параметры культивирования, такие как время культивирования, температура иконцентрации индукторов, а затем модифицированный протокол был апробирован на 10литровом сосуде биореактора.Протокол культивирования штамма-продуцента ИЛ-36РА в колбах подразумевал засев в6 колб вместимостью 2 л по 200 мл культуры в среде 1,5х LB, культивирование в качалке при250 об/мин и температуре +37 °C до достижения оптической плотности 3,0±0,2 ОЕ, добавлениеиндукторов экспрессии генов ИЛ-36РА и (МАП),понижениетемпературы до +30 °C ипродолжение культивирования в течение ещё 3 часов.Для культивации в 1-литровом сосуде были внесены следующие изменения: в среду 1,5хLB была добавлена смесь солей М9, а также в процессе культивирования в биореактор вводилипитательную добавку, состоящую из гидролизата казеина и дрожжевого экстракта, что обычнопозволяет достичь большей плотности культуры.
Культивирование вели при температуре +37°C до исчерпания в среде глюкозы, что фиксировалось защелачиванием средыи резкимснижением потребления кислорода, вводили питательную добавку, затем снижали температурудо +30 °С. После достижения указной температуры добавляли индукторы ИЛ-36РА и МАП.Для отработки оптимального времени культивирование проводили в течение 5 часов с отборомпроб на анализ 1 раз в 15 минут.76Пробное культивирование показало, что количество наработанного белка не прирастаетпосле 3 часов культивирования (Рисунок 23). Полученный ИЛ-36РА содержал менее 5%непроцессированной формы с неотщепленным N-концевым остатком метионина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
